CRISPR/Cas9 mediated genome-editing of the eIF4E gene in Tomato

Abstract

CRISPR/Cas9 (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) 기술의 개발로 거의 모든 유기체에서 유전체 편집을 가능하게 되었다. Eukaryotic translation initiation factor 4E (eIF4E)는 식물의 열성 바이러스 저항성 유전자에 의해 암호화된 단백질이다. 본 연구에서는 토마토 (Solanum lycopersicum cv. Miro-Tom) 에서 유전자교정 (GE)의 대상으로 eIF4E 유전자를 선정하였다. phytoene desaturase (PDS) 또는 eIF4E 유전자를 목표로 하는 gRNA와 Cas9 유전자가 아그로박테리움 매개 방법으로 Miro-Tom에 형질전환하였으며, Cas9과 gRNA가 삽입된 토마토 형질전환체를 얻었다. 전체 113개 중 4개에서 알비노 표현형을 나타내는 유전자교정 식물체를 T0세대에서 얻을 수 있었다. eIF4E 유전자교정 토마토를 얻기 위해, eIF4E 형질전환체의 염기서열 분석을 실시하였다. 총 16개의 형질전환체 중 11개에서 43 베이스페어의 범위의 다양한 결실을 가지는 E0 식물체를 얻었다. E0 식물체들은 자가수분을 하였으며, 5개 eIF4E1 돌연변이체를 얻었다. E2 세대에 Tobacco etch virus (TEV) 접종을 실시하였다. eIF4E1 돌연변이체에서 TEV에 저항성을 보이지 않았으며, 이는 토마토 eIF4E 유전자에 존재하는 유전자중복에 따른 결과로 예상할 수 있었다. 본 연구는 CRISPR/Cas9 기술은 목표하고자 하는 유전자에 돌연변이를 일으키는 유용한 도구로 사용될 수 있음을 보여준다.

The development of Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR)/Cas9 technology has made targeted mutations possible in virtually any organisms. Eukaryotic translation initiation factor 4E (eIF4E) is the protein encoded by recessive virus resistance genes in plants. In this study, the eIF4E gene was chosen as a target for genome editing (GE) in Solanum lycopersicum cv. Micro-Tom. The Cas9 gene together with gRNA for phytoene desaturase (PDS) or eIF4E genes were delivered to Micro-Tom via Agrobacterium-mediated method and transgenic tomato plants carrying Cas9 and gRNA were obtained. The photo bleaching phenotype was observed in four out of 113 explants targeted for PDS demonstrating homozygous GE plants can be obtained in T0 generation. To obtain the eIF4E edited tomato plants, transgenic plants were analyzed by sequencing the eIF4E gene of transgenic plants. A total of 16 eIF4E edited E0 plants containing various sizes of deletion ranging from 11 to 43 bp in eIF4E1 were obtained. E0 plants were self-pollinated and five homozygous E1 mutant lines for eIF4E1 were obtained. Tobacco etch virus (TEV) was inoculated to E2 progeny. No resistance to TEV was observed in two eIF4E1 mutants, which may be due to the redundancy of the eIF4E gene. This study demonstrates that CRISPR/Cas9 technology can be used as a useful tool for mutating to desired targets.