Pretreatment with IFN-γ enhances the immunomodulatory effect of feline adipose tissue-derived mesenchymal stem cells through the COX-2/PGE2 increase

Abstract

Preconditioning with inflammatory stimuli is used to improve the secretion of anti-inflammatory agents in stem cells. However, there are only a few studies on feline stem cells. In this study, the immune regulatory capacity of feline adipose tissue-derived mesenchymal stem cells (fAT-MSCs) pretreated with interferon-gamma (IFN-γ) was evaluated. Pretreatment with IFN- γ increased the expression of cyclooxygenase-2 (COX-2), indoleamine 2,3-dioxygenase (IDO), hepatocyte growth factor (HGF), and transforming growth factor-beta 1(TGF-β1) in the fAT-MSCs. To assess the interaction of lymphocytes and macrophages with IFN-γ-pretreated fAT-MSCs, mouse splenocytes, and RAW 264.7 cells were co-cultured with conditioned media. IFN- γ-pretreated fAT-MSCs increased the expression of M2 markers and regulatory T-cell (Tregs) markers compared to non-preconditioned fAT-MSCs. Further, PGE2 inhibitor NS-398 attenuated the immunoregulatory potential of fAT-MSCs, suggesting that the increased PGE2 induced by IFN- γ stimulation is a crucial factor in the immune regulatory capacity of IFN-γ-preconditioning fAT-MSCs. We demonstrate that IFN- γ pretreatment improves the anti-inflammatory status of fAT-MSC by inducing macrophage polarization and increasing Tregs by activating PGE2 secretion

중간엽 줄기세포(mesenchymal stem cells) 의 항염증 인자의 분비를 향상시키는 방법으로 염증성인자를 줄기세포에 전 처리하는 방법이 있다. 그러나 고양이의 중간엽 줄기세포에 대한 연구는 부족한 실정이다. 따라서 본 학위 논문은 Interferon-gamma (IFN-γ)로 전처리 된 고양이의 중간엽 줄기세포에서 면역 조절 효과를 평가하고자 하였다. IFN-γ로 48시간 동안 고양이의 중간엽 줄기세포에 전처리하여 적응용배지(Conditioned media)를 만들었다. 적응용배지를 역전사 중합효소 연쇄반응(qRT-PCR)을 이용하여 평가하였을 시 Cyclooxygenase-2 (COX-2), Indoleamine 2,3-dioxygenase (IDO), Hepatocyte growth factor (HGF), Transforming growth factor-beta 1(TGF-β1)의 발현이 유의적으로 증가하였다(P < 0.05). 또한 IFN-γ를 전처리한 고양이의 중간엽 줄기세포와 림프구 및 대식세포의 상호관계를 확인하기 위하여 마우스의 비장세포와 마우스의 면역세포(RAW 264.7)를 Concavalin A 와 LPS에 각각 자극한 뒤, 적응용 배지에서 48시간동안 배양하였다. 역전사중합효소연쇄반응(qRT-PCR), 면역형광염색(immunofluorescence staining), 유세포분석(FACS)을 통하여 IFN-γ 전처리 고양이 중간엽 줄기세포배지와 처리하지 않은 순수한 고양이의 중간엽 줄기세포 배지에서 배양한 마우스의 비장세포와 마우스의 면역세포(RAW 264.7) 비교하였다. IFN-γ를 전처리한 고양이의 중간엽줄기세포와 처리되지 않은 고양이의 중간엽줄기세포와 비교하였을 때 LPS의 자극을 받아 증가한 Tumor necrosis factor-α(TNF-α), Interleukin 1β(IL-1β), Interleukin 6(IL-6), Inducible nitric oxide synthase(iNOS)의 발현이 IFN-γ전처리 고양이 중간엽줄기세포와 처리하지 않은 고양이 중간엽줄기세포 적응용 배지에서 배양시에 각각 감소되는 것을 확인할 수 있었다 (P < 0.01). 반면 Arginase와 Interleukin 10(IL-10)은 LPS의 자극을 받아 감소되었으나 IFN-γ전처리 고양이 중간엽줄기세포와 처리하지 않은 고양이 중간엽줄기세포 적응용배지에서 배양시에 발현이 증가되었다 (P < 0.001). Enzyme linked immunoassay를 통해 PGE2를 측정하였을 시 PGE2는 고양이 중간엽줄기세포에서는 833배 IFN-γ를 전처리한 고양이의 중간엽줄기세포에서는 3833배 증가되는 것을 확인하였으나 NS398을 처리한 고양이 중간엽줄기세포에서는 PGE2가 증가되지 않았다 (P < 0.01). PGE2가 면역조절능력에 영향을 미치는 지 알아보기 위하여 RAW 264.7세포 유세포분석을 실시하였다. IFN-γ전처리 고양이 중간엽줄기세포 그룹에서는 CD11b+가 감소한 것을 확인하였고, NS398을 처리한 고양이의 중간엽줄기세포 그룹에서는 CD11b+가 증가하였다 (P < 0.01). 반면, CD206+는 IFN-γ전처리 고양이 중간엽줄기세포 그룹에서 증가하였으나 NS398을 처리한 고양이의 중간엽 줄기세포 그룹에서는 CD206+가 감소하였다 (P < 0.001). 본 연구는 고양이중간엽줄기세포에 IFN-γ을 전처리하여 면역조절능력이 향상되었음을 확인한 보고로 의의가 있으며 이번 연구는 실제 생체 내 실험 및 임상 적용에 대한 기초가 될 것으로 기대된다.