A Distinct Pathogenic Mechanism of Tau Aggregation Involving Hyperubiquitination

Abstract

Tau proteins are natively unfolded and highly basic proteins, contributing to stabilization of axonal microtubule networks in the brain. Under pathological conditions, tau undergoes conformational changes to form insoluble aggregates, which is the proteinaceous signature of a nosological entity termed tauopathies. Several post-translational modifications (PTMs) have been identified as key drivers in tau fibrillation. However, the crosstalk between the PTMs and their consequences on tau degradation and aggregation remains to be elucidated. Here in, I report that phosphorylation of tau induced its hyper-ubiquitination and could be easily aggregated. Purified proteins were used to optimize in vitro PTM assays such as phosphorylation, acetylation and ubiquitination. All PTMs were confirmed by antibodies and the effects of PTM on degradation were also checked using purified 20S proteasome. Only acetylation slightly delayed tau degradation. To dissect the role of phosphorylation on ubiquitination, I sequentially reconstituted biochemical reactions in vitro using recombinant tau. The ubiquitinated tau had K48 linkage specificity and phosphorylated tau showed hyperubiquitination. Intact tau had only 2-3 ubiquitins. Hyperubiquitination was confirmed using methylated ubiquitins. I also identified the sites of phosphorylation and ubiquitination and it found that phosphorylation induces ubiquitination by increasing sites and their intensities. According to in vitro degradation and deubiquitination assays, the hyperubiquitinated tau was degraded by 26S proteasome and deubiquitinated by ubiquitin specific protease 2 (USP2). Acetylation did not have any effects on phosphorylation-induced ubiquitination. When ubiquitination was prolonged, phosphorylated tau generated less soluble hyperubiquitinated tau. In cells, overexpressing tau and E3 Ub ligase, CHIP showed significantly elevated levels of insoluble tau in the presence of proteasome inhibitors and phosphatase inhibitors. These data demonstrate that tau ubiquitination has both anti-aggregation (by degradation) and pro-aggregation (by hyperubiquitination) properties, and that reducing tau ubiquitination combined with proteasome activation may be an effective strategy to reduce levels of pathological tau proteins in cells.

타우 단백질은 자연적으로 펼쳐지고 매우 기초적인 단백질로 뇌의 축삭 미세 소관 네트워크의 안정화에 기여한다. 병리학적 조건 하에서 타우 단백질은 형태가 변하여 용해되지 않는 응집체를 형성하는데, 이러한 병리학적 단백질 응집체에 의한 질환을 타우병증(tauopathies)이라 부른다. 다수의 번역 후 변형 (PTM)은 타우 응집의 주요 원인으로 여겨진다. 그러나 번역 후 변형들의 관계와 타우 분해 및 응집에 대한 이들의 상관관계는 아직 밝혀지지 않았다. 본 연구에서는 타우 단백질의 번역 후 변형의 상관관계에 대한 연구를 수행하며, 타우 단백질의 인산화가 과활성화된 유비퀴틴화를 유도하며 이는 쉽게 응집될 수 있는 것을 확인했다. 정제된 단백질을 사용하여 시험관 내 인산화, 아세틸화, 유비퀴틴화의 최적화를 수립했다. 정제된 20S 프로테아좀을 사용하여 분해에 대한 번역 후 변형의 효과를 확인하였고, 아셀틸화만이 타우 단백질의 분해를 약간 지연시켰다. 유비퀴틴화에 대한 인산화의 역할을 분석하기 위해, 시험관 내에서 번역 후 변형을 순차적으로 수행했다. 타우 단백질은 라이신-48의 결합 특이성을 가졌으며, 인산화에 의해 과활성화된 유비퀴틴화를 보이거나 인산화되지 않은 타우 단백질은 2-3개의 유비퀴틴을 가졌다. 또한 메틸화된 유비퀴틴을 사용하여 과할성화된 유비퀴틴화를 재증명하였다. 게다가 질량 분석을 통해 인산화와 유비퀴틴화의 부위를 확인하였고, 인산화에 의한 유비퀴틴화의 부위와 강도 증가를 보았다. 과활성화된 유비퀴틴화는 정제된 26S 프로테아좀에 의해 분해되고 유비퀴틴 특이적 프로테아제 2에 의해서 탈유비퀴틴화 되는 것을 확인했다. 아세틸화는 인산화에 의해 유도되는 과활성화 유비퀴틴화에 영향을 미치지 않았다. 유비퀴틴화를 장시간 반응시켰을 때, 인산화된 타우는 용해되지 않는 과활성화 유비퀴틴화 타우 단백질의 응집체를 생성하였다. 세포에서 타우 단백질과 타우의 E3 리가아제 CHIP 단백질을 과발현시켰을 때, 프로테아좀 억제제와 인산화 억제제의 존재 하에서 상당히 높은 수준의 불용성 타우를 나타냈다. 이를 통해 타우 단백질의 유비퀴틴화가 응집의 저해 (분해에 대한) 및 응집의 촉진 (과활성화된 유비퀴틴화에 의해) 특성을 가지며, 프로제아좀 활성화와 타우 단백질의 유비퀴틴화를 감소시키는 것이 세포에서 병리학적 타우 단백질의 수준을 감소시키는 효과적인 전략일 수 있음을 제시한다.