벼의 캘러스에서 CRISPR/Cas9 기반 유전자 편집 세포주 구축 및 분석

Abstract

CRISPR/Cas9을 이용한 벼 유전자 편집 연구는 활발하게 진행되고 있지만, 대부분의 연구가 최종적으로 유전자 편집 식물체 생산을 목표로 한다. 따라서 재분화 과정에서 많은 유전자 편집 식물체들이 탈락하게 되고, 이러한 이유로 벼에서 유전자 편집 효율에 관한 연구는 잘 되어있지 않다. 따라서 본 연구에서는 식물체 재분화가 아닌 세포주 구축을 진행하여 많은 유전자 편집 캘러스를 확보하였고, 이를 통해 벼에서 유전자 편집 효율을 분석하였다. 각각 monocot, dicot에 최적화된 3가지 CRISPR/Cas9 발현 벡터를 사용하여 평균 63.31%의 유전자 편집 효율을 확인하였으며, 최적화와 관계없이 높은 유전자 편집 효율을 나타낸다는 것을 확인하였다. 또한, microhomology 분석을 통해 동물 세포와는 달리 식물에서는 microhomology에 의한 MMEJ의 효율이 낮다는 것을 확인하였다. 마지막으로 limiting dilution을 통해 FGF2 유전자가 knock-in 된 캘러스 단일 세포주를 구축하였다. 본 연구를 기반으로 더욱 효과적인 벼 유전자 편집을 도모할 수 있을 것이며, 후속 연구를 통해 RAmy3D 매개 재조합 단백질 발현 플랫폼이 확립된다면 CRISPR/Cas9 knock-in을 통한 다양한 재조합 단백질의 발현에 활용될 수 있을 것으로 기대된다.