Identification and molecular evolutionary analysis of fungal effector proteins

Abstract

최근 염기서열 분석 기술의 발달로 인해 균계의 종합적인 분자진화 및 비교유전체학 연구가 가능하게 되었다. 식물병리학 분야에는 병원유전체학(pathogenomics)이 도입되어 기주식물에 대한 곰팡이의 병원성 요인을 유전체학적으로 설명할 수 있게 되었다. 그 요인 중 가장 대표되는 것은 이펙터(effector)로 이는 곰팡이로부터 기주식물에 전달되어 대사와 생리를 조절한다. 식물병원균의 이펙터 분석이 중요한 이유는 저항성 작물 육종에 필요한 유전자원이며, 효과적이며 지속가능한 식물병 방제 전략의 근간이 되기 때문이다. 그러므로 본 연구는 곰팡이의 유전체로 이펙터 단백질을 예측하는 파이프라인(pipeline)을 구축하였고, 이펙터 유전자의 진화 분석을 통해 곰팡이의 병원성에 대해 이해하고자 하였다. 곰팡이들은 주변 생물과 상호작용하기 위해 다양한 단백질을 분비한다. 이런 단백질들을 분비단백질체(secretome)라 하며, 이 안에는 이펙터를 포함한 다양한 효소가 존재한다. 본 연구는 기존의 이펙터 예측 파이프라인들과 차별화를 두기 위해 곰팡이가 영양을 얻는데 필요한 효소들을 여과하고 기주 친밀성과의 연관성을 분석하였다. 그 결과 분비단백질체와 효소들은 기주 친밀도가 낮은 사물기생균과 반활물기생균에서 높은 비율로 발견되었으나, 기주 친밀도가 높은 활물기생균 및 공생균에서는 낮은 비율로 발견되었다. 반면 이펙터 단백질체 비율의 경우 기주 친밀도가 높은 순서대로 더 높게 발견되었다. 결론적으로 본 연구는 이펙터 예측 파이프라인을 구축하고 곰팡이의 생활양식에 따라 이펙터 단백질체의 비율이 달라진다는 것을 밝혔다. 곰팡이의 생활양식 즉 기주 친밀도에 따라 이펙터 단백질체의 비율이 다른 이유는 결국 기주식물과의 공진화(coevolution) 때문일 것이다. 이펙터의 특성이 종 특이적인 이유 또한 공진화에 의한 것으로, 이펙터는 식물면역을 극복하거나 억제하고, 이에 대응하는 저항성 단백질(resistance proteins)은 이펙터를 인지하여 식물면역을 강화한다. 이처럼 하나의 기주와 병원균에 대한 진화 모델들은 많이 제시되었지만, 아직까지 종 하위 단계에서 기주가 달라짐에 따라 이펙터가 어떻게 기주면역에 적응하는지에 대한 모델은 자세히 알려지지 않았다. 본 연구는 다양한 화본과(Poaceae) 작물 및 잡초를 감염할 수 있는 도열병균(Magnaporthe oryzae)의 유전체를 사용하여 기주 특수화(host specialization)에 대한 기작을 분석하였다. 이를 위해 이펙터 예측 파이프라인으로 벼도열병균 참조 유전체에서 이펙터를 동정하였고 병원형(pathotype)이 다른 균주들의 유전체에서 상동 이펙터(homologous effector)를 발굴하였다. 결과적으로 벼 병원형 균주와 진화적 거리가 멀수록 상동 이펙터의 개수가 감소하였고, 상동 이펙터 유전자의 구조 변이는 진화적 거리가 멀수록 증가하였다. 또한 유전체 상에서는 상동 이펙터 유전자의 주변 요소들이 병원형에 따라 달랐다. 특히 참조 균주의 이펙터 주변에 전이 인자(transposable element)가 있을 경우, 다른 병원형 균주의 상동 이펙터 유전자에 더 많은 서열 및 구조 변이가 일어난 것을 확인하였다. 이러한 변이들은 기주식물의 각기 다른 병원형 균주에 행사하는 선택압(selection pressure)에 의한 것으로 나타났다. 본 연구는 지속적으로 공개되는 곰팡이 유전체에 도입 가능한 분비단백질체 요소 및 이펙터 발굴 파이프라인을 개발하여 분자유전학적 기능 연구에 대한 기반을 마련하였다. 또한 병원형이 다른 도열병균 균주 이펙터 유전자들의 진화 연구를 통해 기주 특수화를 이해하고 일반적인 병원균의 진화 방향 예측에 대한 가능성을 열었다. 궁극적으로 이 결과들은 식물-미생물 상호작용을 이해하는데 새로운 식견을 제공할 것이다.

The recent advancement of sequencing technology has enabled comprehensive molecular evolution and comparative genomics research on Kingdom fungi. In the field of plant pathology, pathogenomics has revealed a plethora of factors in fungal phytopathogens pertinent to pathogenicity. The most versatile group of pathogenic factors at the frontline of plant-pathogen interaction is effectors, which are transferred from a fungus to its host plant to manipulate host metabolism and physiology. Understanding plant pathogen effectors can be instrumental to the discovery of related interactors in plants, providing valuable information for resistant crop and development of sustainable plant disease control strategies. Therefore, in this study, a pipeline has been established to predict effector proteins from fungal genomes and evolutionary analysis of effector genes was conducted to understand the evolutionary trajectory of fungal pathogenicity. Fungi secrete various proteins to interact with surrounding organisms. These proteins constitute the secretome and contain a variety of enzymes, including effectors. The pipeline developed in this study not only predicts effector proteins but also filters the catabolic enzymes, which differentiate it from the existing effector prediction pipelines. The proportions of catabolic enzymes to whole-genome were found to be dependent on the host association of fungi, but effectors were found in higher proportions as the host association increased. The proportion of effector repertoire depending on the fungal lifestyles may be due to coevolution with hosts. The species-specificity of effectors is also due to coevolution, in which the effectors either subvert plant immunity or are recognized by the cognate plant resistance proteins, leading to successful plant defense responses. Many models of evolution for a single pathogen and host have been suggested, but a model for how effectors adapt to host immunity as the pathotype changes at the sublevel of species has not been studied in detail. This study analyzed the mechanism of host specialization using the genome of Magnaporthe oryzae, which can infect various Poaceae crops and weeds. To this end, effectors were identified from the reference genome of M. oryzae using the effector prediction pipeline, and homologous effectors were identified from the genomes of different pathotype strains. As a result, the greater the evolutionary distance from the rice pathotype strain, the lower the number of homologous effectors, and the structural variation of the homologous effector gene increased as the evolutionary distance increased. In the genome, flanking elements of homologous effector genes differed depending on the pathotype. In particular, when there is a transposable element around the effector gene locus of the reference strain, it was confirmed that more sequence and structural variation occurred in the homologous effector genes of other pathotype strains. These variations seem to be attributed to the selection pressure exerted by the different host plants on the strains. This study established an effector mining pipeline that can be used continuously with newly released fungal genomes and will provide a foundation for the molecular genetics study of effector genes. Further, the evolutionary study of the effector genes possessed by different pathotypes of M. oryzae isolates suggests the possibility of understanding host specialization and the evolutionary direction of pathogens. Taken together, these results will provide new insights into understanding the plant-microbe interactions.