Studies of bacteriophage receptor and domains of endolysin for control and detection of Clostridium perfringens

Abstract

Clostridium perfringens is a Gram-positive, anaerobic, and spore forming bacterium that is widely distributed in the environment and is one of the most common causes of foodborne illnesses. Besides, C. perfringens spores are important food contaminants because they can survive high temperature in a dormant state and germinate in a food or in a human body. The increasing prevalence of multidrug-resistant bacteria requires the development of alternatives to typical antimicrobial treatments. Bacteriophages are regarded as one of the most promising alternatives to antibiotics in controlling antibiotic-resistant pathogenic bacteria. In this study, virulent C. perfringens phages CPS1 was isolated. Analysis of CPS1 genome and morphology revealed that CPS1 has a small genome (19 kbps) and a short noncontractile tail, suggesting that CPS1 can be classified as a member of Picovirinae, a subfamily of Podoviridae. To determine its host receptor, the EZ-Tn5 random transposon mutant library of C. perfringens ATCC 13124 was constructed and used for screening to select CPS1 resistant mutant. Analysis of the CPS1-resistant mutants revealed that a gene named CPF_0486 was disrupted by Tn5. The CPF_0486 was annotated as galE, a gene encoding UDP-glucose 4-epimerase (GalE). However, biochemical analyses demonstrated that the encoded protein possessed dual activities of GalE and UDP-N-acetylglucosamine 4-epimerase (Gne). I found that the CPF_0486::Tn5 mutant produced a reduced amount of capsular polysaccharides (CPS) compared with the wild type. I also discovered that glucosamine and galactosamine could competitively inhibit host adsorption of CPS1. These results suggest that CPS acts as a receptor for this phage. To find an alternative antibiotic to control and a biological detection agent against C. perfringens, I isolated and characterized a C. perfringens-specific virulent bacteriophage CPS2 from chicken, additionally. The CPS2 phage contains a 17,961 bp double-stranded DNA genome with 25 putative ORFs, and belongs to the Picovirinae, subfamily of Podoviridae like CPS1 phage. Bioinformatic analysis of the CPS1 and CPS2 genome revealed that both have putative endolysins, LysCPS1 and LysCPS2, respectively. LysCPS1 has a lytic activity at pH 7 to 9 and retains the activity in 0.5 M salt condition at pH 7.5. LysCPS2 showed strong lytic activity against C. perfringens with optimum conditions at pH 7.5–10, 25–65℃, and over a broad range of NaCl concentrations. Interestingly, LysCPS2 was found to be highly thermostable, with up to 30% of its lytic activity remaining after 10 min of incubation at 95℃. The cell wall binding domain (CBD) in the C-terminal region of LysCPS2 showed a binding spectrum specific to C. perfringens strains. The study of LysCPS2 is the first report to characterize highly thermostable endolysin isolated from virulent C. perfringens bacteriophage. In the process of identifying an endolysin LysCPD7 from C. perfringens virulent bacteriophage CPD7, I discovered the spore binding activity of C-terminal region of LysCPD7. The mCherry-fused C-terminal region cannot bind to C. perfringens cells, however, the fusion protein can bind to C. perfringens spores, suggesting that the C-terminal region of LysCPD7 contains a spore binding domain (SBD). Both immunogold electron microscopy and binding assay indicated that the SBD binds to the spore cortex. Bioinformatic analysis of the C-terminal region of LysCPD7 revealed five residues (E187, R192, Q196, K201, E208) supposed to be important for spore binding. Point mutation analysis revealed that two (E187K, R192E) of these five residues are essential for spore binding activity. The LysCPD7 derivatives containing the single point mutation at the four residues (R192E, Q196A, K201E, E208K) showed lower lytic activity compared to the wild-type LysCPD7. I selected the E187K mutant that retains lytic activity as wild type LysCPD7 but impairs spore binding activity. Further, a recombinant phage including E187K of LysCPD7 derivatives was constructed by phage genome editing. The bacterial challenging assay with the recombinant phage or wild type CPD7 phage was performed in C. perfringens sporulation condition. The assay revealed that host cells infected with the recombinant phage showed higher sporulation efficiency than those infected with wild type phage, suggesting that the role of SBD hinders sporulation of the C. perfringens. In this study, I identified a receptor of a C. perfringens-infecting phage CPS1. I characterized endolysins from phage CPS1 and CPS2 as C. perfringens biocontrol agents. CBD and SBD, domains of endolysins, are characterized to detect C. perfringens cells and spores. Further, the biological role of SBD is identified as inhibitor of host sporulation. These results suggest as tools for controlling C. perfringens by application of phage and endolysin. In addition, the results reveal as C. perfringens vegetative cells and spores detection methods by using CBD and SBD of endolysin.

클로스트리디움 퍼프리겐스 (Clostridium perfringens)는 그람 양성 균으로 혐기 조건에서 잘 자라고 포자를 형성할 수 있는 세균이다. 이 세균은 자연 환경에서 흔히 존재하고 식중독을 일으킬 수 있는 주요 병원 균 중 하나이다. 또한, 클로스트리디움 퍼프리겐스가 형성한 포자는 높은 열에도 살아남을 수 있어 포자가 오염된 식품을 충분한 열 처리 없이 조리하여 섭취 시 사람의 장 안에서 균으로 발생하여 식중독을 일으킬 수 있다. 전 세계적으로 항생제 다재 내성균이 증가함에 따라 균을 죽이는데 있어 항생제를 대체할 새로운 물질을 개발하려는 노력이 이루어지고 있다. 박테리오파지는 항생제 대체할 수 있는 물질로 각광받으며 많은 연구가 이루어지고 있다. 본 연구자는 본 연구에서 클로스트리디움 퍼프리겐스에 특이적으로 감염하는 용균성 파지 CPS1을 분리하였다. 유전체 분석 결과 CPS1은 19 kbps의 작은 유전체를 가지고 있었고 작은 비수축성 꼬리를 지니고 있어 Podoviridae의 하위 구성인 Picovirinae로 분류할 수 있었다. CPS1의 숙주 수용체를 알아보기 위하여, 무작위로 유전자를 돌연변이 시킬 수 있는 EZ-Tn5를 사용하여 클로스트리디움 퍼프리겐스 ATCC 13124 돌연변이 라이브러리를 구축하고 CPS1을 감염시켜 CPS1에 살아남는 균주를 분리하고자 하였다. 살아남은 균주 중 유전자 CPF_0486이 망가진 균주를 선별하였다. 이 유전자는 이전에 UDP-글루코오스 4-에피머레이스 (GalE)를 발현하는 galE 유전자로 알려져 있었다. 그러나 CPF_0486에서 발현된 단백질을 생화학적 분석을 통해 알아본 결과, CPF_0486 단백질은 GalE 활성뿐만 아니라 UDP-N-아세틸글루코사민 4-에피머레이스 (Gne) 활성 또한 지니고 있었다. 본 연구자는 CPF_0486 유전자가 돌연변이 된 균주가 야생주에 비해 캡슐 다당질 (capsular polysaccharides)이 감소했음을 알 수 있었다. 본 연구자는 또한 CPS1이 숙주에 흡착 시 글루코사민과 갈락토사민이 각각 경쟁적으로 이를 방해함을 발견했다. 이 결과들은 캡슐 다당질이 CPS1의 숙주 수용체라는 것을 보여준다. 클로스트리디움 퍼프리겐스를 저해하기위한 항생제 대체제와 생물학적 검출 제재를 찾기 위해 본 연구자는 클로스트리디움 퍼프리겐스를 특이적으로 감염하는 박테리오파지 CPS2를 닭 똥으로부터 분리하고 특성을 분석했다. CPS2 파지의 유전체는 18 kbps 정도의 이중가닥 DNA이고 25 개의 해독틀 (open reading frame) 정보를 담고 있다. CPS2 또한 CPS1과 마찬가지로 Podoviridae의 하위 구성인 Picovirinae로 분류할 수 있었다. 생물정보학적 분석을 통해 CPS1과 CPS2 파지의 유전 정보 안에 엔도라이신 (endolysin)으로 추정되는 단백질 LysCPS1과 LysCPS2를 찾아냈다. LysCPS1은 pH 7에서 9 사이에 용균 활성을 보이고 pH 7.5에서 0.5 M 염 농도 안에서도 활성을 가지고 있었다. LysCPS2는 pH 7.5에서 pH 10, 25℃에서 65℃, 그리고 넓은 범위의 염 농도 안에서 강한 용균 활성을 보였다. 흥미롭게도 LysCPS2는 95℃에서 10분 간 두어도 용균 활성의 30%가 보존되는 뛰어난 열 안정성을 보였다. 추가적으로 LysCPS2의 C-말단에 존재하는 세포벽 결합 도메인 (cell wall binding domain)은 클로스트리디움 퍼프리겐스에 특이적으로 붙은 것을 알 수 있었다. LysCPS2는 클로스트리디움 퍼프리겐스 용균성 파지로부터 분리한 내열성 엔도라이신에 관한 첫번째 연구로 그 의의가 있다. 클로스트리디움 퍼프리겐스 용균성 파지 CPD7으로부터 유래한 엔도라이신 LysCPD7을 연구하는 과정 중에 본 연구자는 LysCPD7의 C-말단 부위가 클로스트리디움 퍼프리겐스 포자에 붙는다는 것을 발견하였다. 엠체리 (mCherry) 형광 단백질과 결합한 C-말단 부위는 클로스트리디움 퍼프리겐스 영양 세포 (vegetative cell)에는 붙지 않지만 포자에 붙는다는 것을 알 수 있었고, 이를 포자 결합 도메인 (spore binding domain)으로 명명하였다. 면역 금 전자 현미경 기법 (immunogold electron microscopy)과 부착 정도를 비교하는 기법 (binding assay)을 통해 포자 결합 도메인이 포자피질 (spore cortex)과 포자핵 주변에 붙는 것을 확인하였다. 생물정보학적 분석을 활용하여 LysCPD7 C-말단의 다섯 잔기들 (E187K, R192E, Q196A, K201E, E208K)을 포자 결합에 영향을 미치는 주요 잔기로 추정하였다. 점 돌연변이 기법 (point mutation analysis)에서 추정한 다섯 개의 잔기 중 두 개의 잔기가 포자 결합에 영향을 끼치는 것을 알 수 있었다. 점 돌연변이 LysCPD7 유도체들 중 네 개는 야생형 LysCPD7과 비교해서 활성이 떨어졌다. 이들 중 포자 결합에 영향을 주지만 엔도라이신 활성에는 영향을 주지 않는 E187K 돌연변이를 본 연구에 활용하였다. 추후 연구를 위해 파지 유전체 편집 기술을 사용하여 포자 결합 도메인에 점 돌연변이된 LysCPD7 E187K 돌연변이가 포함된 재조합 박테리오파지를 구축하였다. 야생형 파지와 재조합 파지를 포자 형성 조건에서 키운 클로스트리디움 퍼프리겐스에 접종하여 감염된 숙주의 생장 정도를 분석하는 실험을 진행하였다. 본 실험에서 야생형 파지가 감염된 숙주는 재조합 파지가 감염된 숙주보다 포자를 덜 형성함을 확인하였고, 이를 통해 포자 결합 도메인이 클로스트리디움 퍼프리겐스의 포자 형성을 방해한다는 것을 제안할 수 있었다. 본 연구자는 박테리오파지의 수용체를 규명하였고 엔도라이신의 도메인들에 대해 연구하였다. 본 연구 결과를 통해 파지와 엔도라이신을 활용하여 클로스트리디움 퍼프리겐스를 효과적으로 저해할 수 있는 방법과 더불어 엔도라이신의 도메인들이 세균 검출 기술 개발에 활용될 수 있는 가능성을 제시하였다.