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Structure and Mechanism Investigation of anti-CRISPR AcrIIA1 and AcrIIA5 Proteins
항크리스퍼 단백질 AcrIIA1 및 AcrIIA5 구조 및 작용 메커니즘 규명

DC Field Value Language
dc.contributor.advisor서정용-
dc.contributor.author안소영-
dc.date.accessioned2020-05-19T07:48:54Z-
dc.date.available2020-10-06T01:26:34Z-
dc.date.issued2020-
dc.identifier.other000000160676-
dc.identifier.urihttps://hdl.handle.net/10371/167604-
dc.identifier.urihttp://dcollection.snu.ac.kr/common/orgView/000000160676ko_KR
dc.description학위논문(박사)--서울대학교 대학원 :농업생명과학대학 농생명공학부(바이오모듈레이션전공),2020. 2. 서정용.-
dc.description.abstractClustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR) and CRISPR associated (Cas) genes constitute a prokaryotic adaptive immune system against invading phages and plasmids. To counteract this defense mechanism, phages evolved Anti-CRISPR (Acr) proteins that can inactivate the CRISPR-Cas systems. A number of anti-CRISPR proteins have been shown to potently inhibit subgroups of CRISPR-Cas9 systems. AcrIIA1 and AcrIIA5, encoded by Listeria monocytogenes prophages and Streptococcus thermophilus, are the most prevalent among the Acr proteins targeting type II-A CRISPR-Cas systems (AcrIIA1) and potently inhibits diverse type II-A and type II-C Cas9 homologs (AcrIIA5), respectively. Here, I investigated the structural and functions of the anti-CRISPRs proteins. The AcrIIA1 structure displays its dimeric assembly with a novel two-domain architecture. AcrIIA1 exhibits structural similarity to transcriptional factors in the N-terminal domains. When overexpressed in Escherichia coli, AcrIIA1 associates with RNAs, suggesting that AcrIIA1 functions via nucleic acid recognition. AcrIIA5 reveals a novel α/β fold connected to an intrinsically disordered region (IDR). AcrIIA5 directly interacts with single-guide RNA (sgRNA)-Cas9 complex, and hinders proper association between Cas9 and sgRNA required for the nuclease activity of Cas9. Taken together, the results reveals unique structural and functional features of AcrIIA1 and AcrIIA5, suggesting its distinct mode of action and the diversity of the inhibitory mechanisms employed by Acr proteins.-
dc.description.abstractCRISPR (Clustered regularly interspaced shrot palindromic repeats, 규칙적인 간격을 갖는 짧은 회문구조 반복단위의 배열) 및 CRISPR-associated gene (Cas, CRISPR 연관 유전자) 는 외부 유전자 및 플라스미드 침입에 대한 박테리아와 고세균과 같은 원액 생물체의 면역 시스템이다.
이 방어 메커니즘을 막기 위해 박테리아 파지는 CRISPR-Cas 시스템을 비활성화 할 수 있는 Anti-CRISPR (항크리스퍼) 단백질을 진화시켰다. 다수의 항 크리스퍼 단백질은 CRISPR-Cas 시스템의 서브 그룹을 강력하게 억제하는 것으로 나타났다. 이 논문에선 Listeria monocytogenes 및 Streptococcus thermophiles 의 CRISPR-Cas9 단백질을 억제하는 anti-CRISPR AcrIIA1 및 AcrIIA5의 단백질 구조 및 작용 메커니즘을 규명하였다. AcrIIA1은 8개의 알파헬릭스와 3개의 310헬릭스로 이루어진 두개의 도메인이 이량체로 존재하며 N-말단은 Helix-turn-helix (나선-회전-나선구조), C-말단은 coiled-coil (코일-코일) 구조를 이루고 있다. AcrIIA1은 N-말단 도메인에서 전사 인자와 구조적 유사성을 보이며, 대장균 (E.col)에서 과발현시, AcrIIA1이 핵산 인식을 통해 전사 인자의 가능성을 보였다. AcrIIA5는 7개의 연속된 베타가닥에 두개의 헬릭스가 얹혀져 있는 구조로, 앞쪽 부분에 구조가 없는 20개정도의 아미노산으로 연결되어 있는 단일 구조이다. AcrIIA5는 sgRNA (단일-가이드 리보핵산)-Cas9 복합체와 직접 상호작용을 하고, Cas9을 억제시킨다. 종합하면, AcrIIA1 및 AcrIIA5는 독특한 구조적 및 기능적 특징을 나타내며, 이는 항-크리스퍼 단백질의 독특한 방식 및 억제 메커니즘의 다양성을 시사한다.
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dc.description.tableofcontents1. Introduction. 1
1.1. CRISPR-Cas 1
1.2. Classification of the CRISPR-Cas 2
1.3. Mechanism of the CRISPR-Cas system. 6
1.4. The discovery of Anti-CRISPR proteins. 10
1.5. Anti-CRISPRs mechanism 15
1.6. Anti-CRISPR AcrIIA1 and AcrIIA5 19
2. Materials and Methods. 21
2.1. Cloning 21
2.1.1. AcrIIA1 and AcrIIA1 L52M 21
2.1.2. AcrIA5 and AcrIIA5 mutants 21
2.2. Protein expression 22
2.2.1. Luria bertani medium 22
2.2.2. Selenomethionine labeling 22
2.2.3. Isotope labeling medium 23
2.3. Purification 26
2.3.1. AcrIIA1 and AcrIIA1 L52M. 26
2.3.2. SinR. 26
2.3.3. AcrIIA5 and AcrIIA5 mutants. 27
2.3.4. N-terminal truncation mutants of AcrIIA5 28
2.3.5. SpyCas9 28
2.4. Size exclusion chromatography 29
2.5. Crystallization, data collection and structure determination 29
2.6. Analysis of co-purifying nucleic acids 32
2.7. Isothermal Titration Calorimetry 33
2.8. NMR spectroscopy 33
2.9. Structure calculation 33
2.10. Electrophoretic mobility shift assay. 36
2.10.1. AcrIIA1 36
2.10.2. AcrIIA5 36
2.11. In vitro cleavage assay 37
2.11.1. DNA cleavage assay 37
2.11.2. RNA cleavage assay 37
2.12. sgRNA preparation. 37
3. Results (AcrIIA1) 40
3.1. Structural analysis of AcrIIA1 41
3.2. Structural feature of AcrIIA1 42
3.3. Structural similarity to HTH transcription factors. 54
3.4. AcrIIA1 interacts with RNAs 64
4. Discussion. 67
5. Conclusion 74
6. Results (AcrIIA5) 75
6.1. Resonance assignment of AcrIIA5 76
6.2. NMR Backbone assignment of AcrIIA5 76
6.3. AcrIIA5 adopts a novel fold with an IDR. 84
6.4. AcrIIA5 disrupts functional Cas-sgRNA assembly. 92
6.5. N-terminal disorder of AcrIIA5 is crucial for Cas9 inhibition 100
7. Discussion 115
8. Conclusion. 126
9. References. 127
Abstract in Korean 134
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dc.language.isoeng-
dc.publisher서울대학교 대학원-
dc.subject.ddc571-
dc.titleStructure and Mechanism Investigation of anti-CRISPR AcrIIA1 and AcrIIA5 Proteins-
dc.title.alternative항크리스퍼 단백질 AcrIIA1 및 AcrIIA5 구조 및 작용 메커니즘 규명-
dc.typeThesis-
dc.typeDissertation-
dc.contributor.AlternativeAuthorAn, So Young-
dc.contributor.department농업생명과학대학 농생명공학부(바이오모듈레이션전공)-
dc.description.degreeDoctor-
dc.date.awarded2020-02-
dc.identifier.uciI804:11032-000000160676-
dc.identifier.holdings000000000042▲000000000044▲000000160676▲-
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College of Agriculture and Life Sciences (농업생명과학대학)Dept. of Agricultural Biotechnology (농생명공학부)Theses (Ph.D. / Sc.D._농생명공학부)
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