Graphene and DNA based biomaterials for diagnosis and anticancer therapy

Abstract

질병의 진단과 치료에 있어서 생체재료의 활용은 최근 그 분야를 넓혀가고 있으며, 특히 생체적합성의 특징으로 인해 부작용을 최소화 하는 물질로 각광받고 있다. 그래핀 옥사이드 나노 시트는 그 자체의 표면적이 넓고 풍부한 자유전자로 인해 아로마틱 링 구조를 가진 화합물질과 결합력이 뛰어나다. 뿐만 아니라 DNA 단일가닥, 지질사슬과도 뛰어난 결합력을 가지므로 다양한 물질로 표면 수식이 가능하다. 이러한 물질들로 표면이 수식되면 생체내 안정성을 증진 될 뿐만 아니라 세포내 침투력을 강화시켜 약물전달을 효율적으로 시킬 수 있다. 그래핀 표면의 수식 방법 및 수식 물질에 의해 변화무쌍하게 활용될 수 있으며 그 효율 또한 극대화 시킬 수 있다. 본 논문에서는 아로마틱 링 구조를 포함한 페닐알라닌 펩타이드를 활용하여 그래핀 나노 시트의 약물 전달체로서의 효과를 극대화시켰으며, 그 수식 방법을 간소화 함으로써 활용범위를 다변화 시켰다. 7개의 페닐알라닌 잔기를 기능성 펩타이드(세포 침투 보조 펩타이드)에 추가하여 키메릭 펩타이드를 합성하였고, 이를 그래핀 나노시트에 파이-파이 결합으로 수식하여 세포내 침투율을 높혔다. 근적외선을 쪼여 줌으로써 그래핀의 광열효과까지 확인하였다. 그래핀 옥사이드 나노시트에 특정 물질 감응형 aptamer를 형광과 함께 수식하면 질병의 진단영역에 활용할 수 있다. 그래핀 옥사이드는 형광물질과 쉽게 결합하며 발광을 억제 시킬 수 있는 생체재료이다. 형광물질에 DNA 이중가닥을 수식시키면 그래핀으로부터 이격되어 발광을 유지시킬수 있는 원리를 이용하여 DNA-그래핀 기반 질병 진단체를 개발하였다. DNA 이중가닥은 특정 물질에 감응하여 단일가닥으로 해체되고 그로 인해 단일가닥 DNA에 수식되어 있는 형광은 물질 특이적으로 빛을 잃게 된다. 본 연구에서는 인터페론 감마 특이적 aptamer를 활용하여 HIV 진단체를 설계하였다. 마지막으로 Rolling circle amplification(RCA) 법을 활용한 DNA중합체는 생체적합한 물질일 뿐만 아니라 생분해성이기에 약문전달분야에서 널리 활용되고 있다. 무엇보다 그 서열의 조작이 용이하여 다양한 결과물을 생산할 수 있어 그 용도가 무궁무진하다. 본 연구에서는 RCA-DNA 중합체를 면역항암치료에 접목하였다. 뿐만 아니라 정교한 유전자 가위인 CRISPR Cas9을 도입하여 RCA-DAN 중합체가 생체 내에서 정확한 서열의 치료 aptamer(PD-1 aptamer)를 방출하도록 하였다. 그 결과 대조군 대비 뛰어난 항암 면역치료 효과를 확인할 수 있었으며, 이 시스템을 활용하여 다양한 aptamer의 항암 치료 효과 극대화를 기대해 본다.

Here, we report a double-stranded, dual-anchored, fluorescent aptamer on reduced graphene oxide (rGO) for the sensitive, selective, and speedy detection of a target protein in biological samples. This nano detector is composed of a target protein-specific fluorescent aptamer with BHQ1 as one anchoring moiety that forms double-stranded sequences with a complementary oligonucleotide sequence with BHQ1 as the other anchoring moiety, anchored to rGO nanosheets. The double-stranded and dualanchored aptamer on rGO nanosheets (DAGO) exhibited 7.3-fold higher fluorescence intensities compared to a single-stranded, single-anchored fluorescent aptamer on rGO. As a model target protein, interferon-g was used. DAGO detected the target protein, with linearity over a five-orders-of-magnitude concentration range (0.1 ng/mle10 mg/ml) in buffer and human serum. DAGO was highly specific for the target protein, exhibiting little changes in fluorescence intensity in response to the non-target proteins, interleukin-2 and tumor necrosis factor-a. Moreover, DAGO allowed rapid quantification of the target protein in human immunodeficiency virus-positive patient serum samples. DAGO-based detection was complete in less than 10 min. Our results indicate that the DAGO provides new opportunities for the rapid and specific detection of target proteins in biological samples and could be widely applied to quantitate various target proteins by replacing the aptamer sequences. Second, we also report the non-covalent functionalization of reduced graphene oxide (rGO) nanosheets using chimeric peptides engineered to have a biologically functional sequence, a spacer sequence, and an rGO-binding sequence. As a model peptide with biological activity, the cell-penetrating peptide buforin IIb (Bu) was used. A stretch of seven consecutive phenylalanine residues (7F) was used as the rGO-binding sequence. The various effects of tetraglycine (4G) and tetra-aspartate (4D) as spacers between the biologically active Bu and the rGO-binding 7F sequences were compared. All the chimeric peptides had a-helical structures at the carboxyl-terminal sequence, showing a structural similarity to the a-helical structure of Bu alone. Free chimeric peptides composed of 7F-Bu, 7F4G-Bu, or 7F4D-Bu in solution exhibited cell-penetrating abilities similar to that of Bu alone. However, following attachment onto rGO nanosheets, the compositions of the chimeric peptides affected the biological activity of Bu. Following modification, the 7F4D-Bu chimeric peptide yielded a higher cellular uptake of the rGO nanosheets than the other chimeric peptides. The levels of cellular uptake of the rGO nanosheets modified with the chimeric peptides were further evaluated by measuring the photothermal effect after near-infrared laser irradiation. The cells treated with 7F4D-Bu-modified rGO showed the greatest increase in temperature upon irradiation, with the temperature reaching 58.3 °C. The 7F4D-Bu-modified rGO also exhibited the highest photothermal cell-killing activity upon near-infrared laser irradiation. Our results demonstrate the utility of chimeric peptide engineering for simple and facile one-step non-covalent modification of rGO. The chimeric peptide composed of 7F4D can be further used to tether various functional peptides onto rGO nanosheets. Lastly Immune checkpoint inhibitors have been widely studied in immunotherapy. Although antibodies have been more widely used to block immune checkpoints, DNA aptamers have unique advantages for this purpose. Here, we designed a DNA polyaptamer hydrogel that can be precisely cut by Cas9/sgRNA for programmed release of an immune checkpoint-blocking DNA aptamer. As a representative immune checkpoint inhibitor, we used a PD-1DNA aptamer. Rolling-circle amplification was used to generate a hydrogel comprising DNA with PD-1 aptamer and an sgRNA-targeting sequence. When mixed with Cas9/sgRNA, the PD-1 DNA aptamer hydrogel (PAH) lost its gel property and liberated the PD-1 aptamer sequence. The precise Cas9/sgRNA-mediated release of the PD-1 DNA aptamer, which was confirmed by gel electrophoresis, was found to effectively activate the cytokine-secretion function of splenocytes. In vivo, molecular imaging revealed that PD-1 DNA polyaptamer hydrogel coinjected with Cas9/sgRNA (Cas9/PAH) remained at the injection site longer than free aptamer and yielded significantly higher antitumor effects and survival than hydrogel or free aptamer. Moreover, increased immune cell filtration was observed at tumor tissues treated with Cas9/PAH. These results suggest that our Cas9/sgRNAedited immune checkpoint-blocking aptamer hydrogel has strong potential for anticancer immunotherapy.