Role of Vitamin D in Protecting the E-cadherin Junction of Gingival Keratinocytes

Abstract

Despite the well-known anti-inflammatory effects of vitamin D in periodontal health, its mechanism has not been fully elucidated. In the present study, the effect of vitamin D on strengthening E-cadherin junctions (ECJs) was explored in human gingival keratinocytes (HGKs). ECJs are the major type of intercellular junction within the junctional epithelium, where loose intercellular junctions develop and microbial invasion primarily occurs. HOK-16B cells, an immortalized normal human gingival cell line, were used for the study. To mimic the inflammatory environment, cells were treated with tumor necrosis factor-alpha (TNF-α). Matrix metalloproteinases (MMPs) in the culture medium were assessed by an MMP antibody microarray and gelatin zymography. The expression of various molecules was investigated using western blotting. The extent of ECJ development was evaluated by comparing the average relative extent of the ECJs around the periphery of each cell after immunocytochemical E-cadherin staining. Vitamin D receptor (VDR) expression was examined via immunohistochemical analysis. TNF-α downregulated the development of the ECJs of the HGKs. Dissociation of the ECJs by TNF-α was accompanied by upregulation of MMP-9 production and was suppressed by a specific MMP-9 inhibitor. Exogenous MMP-9 decreased the development of ECJs. Vitamin D reduced the production of MMP-9 and attenuated the breakdown of ECJs in the HGKs treated with TNF-α. In addition, inhibition of nuclear factor kappa B (NF-κB) signaling attenuated the lowered development of ECJs in the HGKs treated with TNF-α. Vitamin D also downregulated TNF-α-induced nuclear factor kappa B (NF-κB) signaling in the HGKs. VDR was expressed in the gingival epithelium, including the junctional epithelium. These results suggest that vitamin D may avert TNF-α-induced downregulation of the development of ECJs in HGKs by decreasing the production of MMP-9, which was upregulated by TNF-α. Vitamin D may reinforce ECJs by downregulating NF-κB signaling, which is upregulated by TNF-α. Vitamin D may protect the periodontium from bacterial invasion by strengthening the epithelial barrier.

치주 건강에서 비타민 D의 항 염증 효과는 잘 알려져 있지만, 그 작용 기전은 완전히 밝혀져 있지 않다. 본 연구에서는 치은각화상피세포에서 E-cadherin 접합 강화에 대한 비타민 D의 효과에 대해 연구하였다. 구강 조직에서 상피 장벽은 미생물이나 독소의 침입을 막는데 필수적이기 때문에, 세포 간 온전한 접합을 유지하는 것이 중요하다. 치은 접합 상피는 특징적으로 세포 간 접합이 산발적이고 느슨하여 쉽게 세균이 침투할 수 있다. 이 접합 상피에서의 주요한 세포 간 접합의 유형은 E-cadherin 접합이다. 본 연구는 불멸화된 정상 사람 치은 각화상피세포주인 HOK-16B 세포를 사용하였고, 염증 환경 모방을 위해 세포를 TNF-α로 처리하였다. 배양액에 함유된 MMP-9의 정량적 확인을 위해서 MMP antibody microarray 방법과 zymography 방법을 사용하였다. 세포 내 분자의 발현 분석은 immunoblotting 방법을 사용하였다. 세포 간 접합의 발달 정도는 면역세포화학법으로 E-cadherin을 염색하여 각 세포에 발달한 E-cadherin 접합의 상대적인 발달 정도를 측정하였다. E-cadherin 접합의 상대적인 발달 정도는 각 세포에서 E-cadherin 접합의 길이를 각 세포의 전체 접합의 길이로 나누어 구하였다. 치은에서 비타민 D 수용체의 발현은 면역조직화학법으로 조사하였다. 연구 결과로 TNF-α는 치은각화상피세포에서 E-cadherin 접합의 발달을 저해하였다. TNF-α에 의한 E-cadherin 접합의 발달 저해는 MMP-9 생산 증가에 의해 일어나고, 이 현상은 MMP-9의 억제제를 처리함에 의해서 억제됨을 확인하였다. 더불어, E-cadherin 접합의 발달은 외인성의 MMP-9에 의해서 저하되었다. 한편 비타민 D는 TNF-α에 의한 MMP-9의 생산 증가를 감소시킴으로써, E-cadherin 접합의 발달 저해를 감소시켰다. 치은각화상피세포에서 TNF-α에 의한 E-cadherin 접합의 발달 저하는 nuclear factor kappa B (NF-κB) 신호전달을 억제함으로써 피할 수 있었는데, 비타민 D도 역시 TNF-α에 의한 NF-κB 신호전달 활성화를 억제하였다. 비타민 D 수용체는 접합상피를 포함하여 치은상피조직에서 뚜렷하게 발현되었다. 이러한 결과는 TNF-α가 사람치은각화상피세포에서 MMP-9 생산을 증가시켜 E-cadherin 접합의 발달을 저해하는데, 비타민 D는 TNF-α에 의한 MMP-9의 생산 증가를 억제함으로써 E-cadherin 접합의 발달 저하를 막을 수 있음을 보여준다. 또한 이러한 비타민 D의 효과는 TNF-α에 의한 NF-κB 신호전달의 활성화를 억제함으로써 가능함을 보여준다. 이로서 본 연구는 비타민 D가 상피 방어벽을 강화시켜 박테리아 침입으로부터 치주조직을 보호할 수 있음을 시사한다.