Microbially induced calcium carbonate precipitation to prevent soil erosion in heavy metals-contaminated sites as a measure of risk mitigation

Abstract

토양에 오염된 중금속은 주변 수용체(인체 및 생태)에 위해를 야기할 수 있으며 따라서 이를 방지하기 위한 조치가 취해져야 한다. 매우 넓은 부지가 상대적으로 낮은, 그러나 독성 영향을 보이는 수준으로 오염된 경우에는, 오염 정화에 매우 큰 비용과 시간이 소요될 수 있다. 본 연구는 토양 안정화 기술로서 미생물 매개 탄산칼슘 침전을 활용하여, 강우로 인한 토양 유실을 방지함으로써 중금속을 함유한 토양 입자가 인근 수계나 부지 외부 토양으로 확산되는 것을 방지하고자 하였다. 기술 적용을 통해 오염부지 인근 수용체에 대한 중금속의 노출을 차단하여 수용체를 잠재적인 위해로부터 보호할 수 있을 것으로 기대된다. Sporosarcina pasteurii 종을 미생물 매개 탄산칼슘 침전을 위한 요소가수분해미생물로 사용하였다. 이 종은 최대 1 M의 요소 및 칼슘 농도 용액에서까지 요소 가수분해를 통한 탄산칼슘 침전을 일으킬 수 있었으며, X선 회절분석(X-ray diffraction; XRD) 결과 침전된 탄산칼슘의 결정은 방해석(calcite)과 바테라이트(vaterite)였다. 미생물 매개 탄산칼슘을 유도하기 위해 요소, 칼슘, S. pasteurii가 포함된 용액을 모래에 주입하였을 때, 토양 입자의 표면에 탄산칼슘 침전물이 생성된 것을 주사전자현미경(Scanning Electron Microscope; SEM)을 통해 관찰하였다. 그러나 탄산칼슘 침전물의 양이 동일하더라도, 탄산칼슘 침전물의 크기 및 분포는 침전 유도 용액의 조성이나 농도에 따라 큰 차이를 보였다. 저농도의 용액을 반복적으로 주입하거나 영양분(본 연구에서는 tryptic soy broth를 사용)을 함께 주입하는 경우 크기가 크고 집중된 형태의 탄산칼슘 침전물이 형성되었다. 이러한 특성의 탄산칼슘 침전물이 토양 입자간 결합을 형성하는 데에 유리할 것으로 판단하고, 요소 450 mM, 염화칼슘 450 mM, 4 g/L tryptic sot broth 및 S. pasteurii를 이러한 특성의 침전물을 확보할 수 있는 용액 조성으로 결정하였다. 결정한 조성의 용액을 모래에 반복적으로 주입함에 따라 탄산칼슘 침전물의 농도는 주입 횟수에 비례하여 증가하였다. 용액의 1회 적용은 9.7 mg-CaCO3/g-sand의 탄산칼슘 침전을 일으켰으며, 따라서 용액을 5회 적용하였을 때 46.2±1.8 mg-CaCO3/g-sand의 탄산칼슘을 확보하였다. 탄산칼슘이 토양 입자를 결합함에 따라 토양의 강도가 증가하므로, 관입시험계(penetrometer)를 사용하여 토양 표면의 강도를 측정하였다. 관입저항(penetration resistance)은 용액을 5회 적용할 때까지는 탄산칼슘 침전량이 증가함에 따라 함께 증가하여 23.9±1.2 N/mm에 도달하였으나, 이후에는 탄산칼슘 침전량이 증가하여도 더 이상 증가하는 경향을 보였다. 모래에 더해 유기물함량 2.6의 사양토를 대상으로 미생물 매개 탄산칼슘을 적용하고, 다양한 강우 강도와 경사도 조건에서 인공강우시험을 수행하였다. 용액을 5회 주입한 결과, 시험 조건 중 가장 강한 조건이었던 강우 강도 75 mm/hr 및 경사도 15도 조건의 인공강우시험에서 토양 유실률이 모래에서 94%, 사양토에서 58% 감소한 것을 확인하였다. 두 토양에서 탄산칼슘 침전물의 양은 유사할 것이므로, 토양입자크기와 유기물함량이 미생물 매개 탄산칼슘 침전 적용에 따른 토양 강도 증가 및 토양 유실률 감소에 영향을 미친 것으로 판단하였다. 다양한 입자 크기의 모래에 침전 용액을 5회 주입하고 관입저항을 측정한 결과, 동일한 적용 수준에서 관입저항은 150~500 μm 크기의 모래에서 23.9±1.2 N/mm로 가장 높고, 500~1000 μm 크기의 모래에서 13.1±0.1 N/mm, 75~150 μm 크기의 모래에서 7.0±0.0 N/mm의 순으로 낮아졌다. 특히, 유기물함량의 영향이 두드러졌는데 유기물함량을 0, 1, 2.5, 5%로 조절한 모래에 침전 용액을 5회 주입한 경우, 탄산칼슘 침전량은 유사한 반면 관입저항은 유기물함량이 높은 토양으로 갈수록 23.9±1.2에서 17.0±4.1, 6.4±0.4, 3.0±0.5 N/mm로 감소하였다. 주사전자현미경을 통해 탄산칼슘 침전물을 관찰한 결과, 유기물함량이 높은 모래에서 작은 크기의 침전물이 형성된 것을 확인하였다. 용존유기탄소(dissolved organic carbon; DOC)가 탄산칼슘 결정의 성장을 방해하고 그 결과 토양 입자간 결합이 효과적으로 형성되지 못해 관입저항이 낮은 것으로 판단되었다. 침전된 탄산칼슘이 토양 입자간 결합을 형성하는 정도를 분석하기 위해 미생물 매개 탄산칼슘 침전이 적용된 모래를 대상으로 X선 컴퓨터 단층촬영(X-ray CT)과 객체기반영상분석을 수행하였다. 침전 용액이 주입됨에 따라 탄산칼슘 침전물이 각 모래 입자의 표면에 축적, 성장하여 모래 입자 사이의 공극을 채우면서 입자가 탄산칼슘으로 결합되는 것을 확인하였다. 3차원 영상처리를 통해 침전 용액을 적용하지 않은 시료의 각 모래 입자를 개별 객체로 분리하고, 동일한 처리방법을 침전 용액을 적용한 시료에 적용하였다. 이와 같은 처리를 통해 결합이 형성된 입자들을 하나의 객체로 인식하도록 하고, 결합에 따라 각 객체의 유효반지름이 증가하는 것을 토대로 결합의 형성 정도를 분석하였다. 유효반지름의 분포를 토대로 분석한 결과, 침전 용액의 주입 횟수가 증가함에 따라 유효반지름이 커지는 경향을 보였다. 특히, 침전 용액을 5회 이상 주입하였을 때 그 차이가 두드러졌는데, 5회 주입의 경우 전체 입자 부피의 55%가 하나의 입자로 결합되어 있었으며, 주입 횟수가 9회로 증가함에 따라 그 비율은 95%로 증가하였다. 탄산칼슘을 통한 토양입자의 연결점 수 또한 증가하다가 5회 이상 주입하였을 때 평균 6개/입자로 수렴하였다. 이러한 경향들은 주입 횟수에 따라 관입저항이 증가하는 경향과 유사하였다. 추가로, 탄산칼슘 침전물의 크기에 영향을 미쳤던 요인인 영양분과 용존유기탄소에 의한 결합 형성 정도 차이를 분석하였다. 5회의 동일한 적용 수준에서, 용존유기탄소가 존재하거나 영양분이 존재하지 않았던 경우 탄산칼슘 침전물에 의한 결합 정도가 두드러지게 감소하는 것이 확인되었다. 이러한 결과는 용존유기탄소와 영양분의 존재 유무가 탄산칼슘 침전물의 정성적인 특성(크기 및 분포)에 영향을 미치고, 결과적으로 결합 정도와 토양 강도에까지 영향을 미치게 되는 것을 뒷받침한다. 미생물 매개 탄산칼슘 침전의 잠재적인 저해요인으로 판단한 구리로 오염시킨 토양에서 기술의 적용성을 평가하였다. 미생물 매개 탄산칼슘 침전의 핵심 단계인 요소 가수분해는 토양을 25 mg/kg 수준의 구리로 오염시켰을 때에도 50% 가량 감소하였으며, 구리 오염농도가 1000 mg/kg까지 증가함에 따라 그 감소율 또한 증가하였다. 토양에서의 독성 영향을 판단할 때에는 토양 용액의 구리 농도가 더욱 중요하므로, 토양 용액의 구리 농도를 기반으로 토양 구리의 저해효과를 평가하였다. 요소 가수분해를 50% 저해하는 농도(IC50)는 pH가 7.8인 모래에서 1.3 mg-Cu/L, pH가 5.2인 사양토에서 0.9 mg-Cu/L로 결정되었다. 토양의 구리 농도가 250 mg/kg으로 동일하여도, 오염기간이 긴 토양에서 낮은 저해효과(모래에서 85%에서 57%로 감소, 사양토에서 97%에서 93%로 감소) 가 나타났는데, 이는 오염기간이 긴 토양에서 토양 용액 내 구리 농도가 낮기 때문이었다. 미생물 매개 탄산칼슘 침전의 토양 침식 방지 효과를 구 제련소 부지에서 채취한 세 가지 종류의 중금속 오염토양을 대상으로 평가하였다. 세 토양에서 분석한 토양 용액의 구리 농도는 각각 0.28±0.00, 0.26±0.06, 0.15±0.03 mg-Cu/L로 앞서 결정한 IC50 보다 낮은 수준이었으며, 따라서 기술적용이 가능한 것으로 판단하였다. 토양 침식을 방지할 수 있는 수준의 토양 강도를 확보하기 위해, 유기물함량이 0.8, 1.4, 2.0%인 각 토양에 침전 용액을 각각 3회, 4회, 5회 주입하였다. 기술 적용에 따라, 강우강도 33 mm/hr 및 경사도 8.5도의 강우조건에서 토양 유실률이 각각 69, 82, 56% 감소된 것을 확인하였다. 추가로, 미생물 매개 탄산칼슘 침전의 핵심 물질인 칼슘이 토양 내 치환성으로 흡착되어 있는 구리의 탈착을 증가시켜 토양 용액 내 구리 농도 및 미생물 매개 탄산칼슘 침전에 대한 저해 효과를 높이는 것을 확인하였다. 본 연구를 통해 미생물 매개 탄산칼슘 침전 용액의 조성과 토양 특성에서 유발된 성분이 탄산칼슘 침전물에 의한 토양 입자 결합에 영향을 줄 수 있음을 탄산칼슘 침전물의 정성적인 특성과 결합 정도, 토양 강도 증가에 기반하여 포괄적으로 살펴보았다. 다양한 특성의 토양과 실제 중금속 오염토양에서 토양 침식 방지 효과를 확인한 본 연구결과를 토대로, 미생물 매개 탄산칼슘 침전을 중금속 오염토양에서 토양 침식 방지를 통한 효과적인 위해저감조치로써 사용할 수 있을 것으로 사료된다.

Heavy metals contamination in soil may pose health problems to nearby receptors (i.e., human beings, ecosystems) and thus should be treated. When a large area is contaminated with relatively low concentrations of heavy metals but still exhibits toxic effects, tremendous cost is incurred to remediate the site; moreover, the time for remediation may sometimes be too long. This study focused a soil stabilization using microbially induced calcium carbonate precipitation (MICP), which inhibits the rainfall-induced soil erosion and prevents the introduction of contaminated soil particles into the surface water and off-site soil. By applying MICP, receptors near the contaminated site are essentially protected from the exposure of heavy metals; thus, potential risk is likely to be reduced. Sporosarcina pasteurii (S. pasteurii) species was used as a key mediator for MICP. It can precipitate calcium carbonate in a solution containing high concentrations of urea and calcium of up to 1 M. The precipitated calcium carbonate was determined to be calcite and vaterite by X-ray diffraction analysis. When the solution to induce MICP, which included urea, calcium, and S. pasteruii, was applied into sand, a test soil in this study, the precipitate of calcium carbonate was observed on the surface of soil particles by scanning electron microscopy (SEM) analysis. Interestingly, the sizes and distributions of calcium carbonate precipitates were considerably different according to the composition of the MICP-inducing solution that was used, even for similar amounts of calcium carbonate precipitates. Repeated application with lower source concentration (i.e., urea and calcium) and the presence of a nutrient contributed to a larger and concentrated precipitates of calcium carbonate, which was expected to be advantageous in forming bond between soil particles. Finally, the composition of MICP-inducing solution was determined to be 4 g/L of tryptic soy broth, 450 mM each of CaCl2 and urea, and S. pasteurii. As the MICP-inducing solution was repeatedly applied into sand, the concentrations of calcium carbonate precipitates were proportionate to the number of applications. A one-time application generated 9.7 mg of calcium carbonate per gram of sand, and 46.2±1.8 mg of calcium carbonate precipitate per gram of sand was observed after five repeated applications. As calcium carbonate binds soil particles together and yields aggregates with increasing soil strength, the strength was measured by using a penetrometer. Penetration resistance increased as the concentration of newly formed calcium carbonate increased linearly up to the fifth application of MICP-inducing solution; however, no further increase was observed in subsequent applications. After the fifth application, a penetration resistance of 23.9±1.2 N/mm was attained. An artificial rainfall test was conducted with sand and sandy loam with organic matter content of 2.6%. To simulate diverse field situations, various rainfall intensities and slopes were tested. At the harshest condition tested (i.e., rainfall intensity of 75 mm/h, slope of 15°), approximately 94% of loss reduction was obtained after five repeated applications in the sand; however, the loss rate decreased to only 58% in the sandy loam. As the generated concentrations of calcium carbonate precipitates in the two types of soils were similar, it is probable that the differences in particle size and organic matter content influenced the soil strength and resulted in varying reductions in soil loss rate. Further experiments with sand samples of different particle size showed that; after the fifth application, the penetration resistance was the highest (i.e., 23.9±1.2 N/mm) in medium-sized sand (150-500 μm), followed by a penetration resistance of 13.1±0.1 N/mm in coarse sand (500-1000 μm), and that of 7.0±0.0 N/mm in fine sand (75-150 μm). The effect of organic matter content was more pronounced. After the fifth application, the penetration resistance decreased from 23.9±1.2 to 17.0±4.1, 6.4±0.4, and 3.0±0.5 N/mm corresponding to the increase in organic matter content from 0 to 1, 2.5, and 5%, respectively. Further, in SEM analysis, smaller sizes of calcium carbonate were observed in the soil with higher organic matter content. The dissolved organic carbon (DOC) may inhibit the growth of calcium carbonate precipitates, resulting in ineffective precipitates forming bond between soil particles, and thereby generating less increase in penetration resistance. To analyze the extent of the bonding between soil particles by calcium carbonate precipitates, X-ray computed tomography (X-ray CT) and an object-based image analysis were conducted on MICP-applied sand. As the MICP-inducing solution was applied repeatedly, it was observed that calcium carbonate precipitates grew on the surface of each sand particle, filled the void space among these particles, and finally formed the bond between soil particles. Using three dimensional image processing, the sand particles of the sample without MICP application were separated into individual objects, and the same process was applied to the samples with MICP application. By this process, the sand particles that bonded with calcium carbonate precipitates were recognized as one object; moreover, the extent of bonding was analyzed based on the increase in the effective radius of the object. The effective radius of each individual object increased as the number of MICP applications increased. After five repeated MICP applications, one large particle, which occupied 55% of the volume of the total particles, was formed; further, the volume of one large particle increased up to 95% after nine applications. The number of calcium carbonate bonds also increased; however, an average of six bridges/particle was observed after five MICP applications. These trends were similar to that of the increase in penetration resistance corresponding to the number of applications. Additionally, the effect of the nutrient and DOC, which were factors affecting the qualitative characteristics of calcium carbonate precipitates, on the extent of bonding was assessed. The effective radius was significantly smaller when DOC was present in the solution and was larger when the nutrient was absent, at the same number of MICP applications (i.e., five times). This result supported that the difference in the size of calcium carbonate precipitates, which was affected by the composition of the MICP-inducing solution or organic carbon, can qualitatively contribute to the difference in bonding and the increase in the strength of the MICP-applied soil. The applicability of MICP was assessed in Cu-contaminated soil because Cu is a potential inhibitor for MICP in soil. Urea hydrolysis, a crucial step of MICP, was reduced up to 50% in the soil contaminated even with 25 mg-Cu/kg; moreover, it decreased continuously as the Cu concentration in the soil increased up to 1,000 mg/kg. As the Cu concentration in the soil solution contributes significantly to the toxic effect, the inhibitory effect of Cu in soil was evaluated based on the Cu concentration of the soil solution. The half maximal inhibitory concentration (IC50) of Cu was determined to be 1.3 mg-Cu/L in sand (pH 7.8) and 0.9 mg-Cu/L in sandy loam (pH 5.2). Even at identical Cu concentrations of 250 mg/kg, the inhibition rate decreased as it aged (i.e., 85 to 57% in sand and 97 to 93% in sandy loam), which was highly correlated to the reduction in the Cu concentration of the soil solution. The developed technology was tested in three types of heavy metal-contaminated field soils from a former smelter site. The lower Cu concentration in the soil solution of the three soils (i.e., 0.28±0.00, 0.26±0.06, and 0.15±0.03 mg/L) indicated that MICP could be applied. To obtain the strength to prevent soil erosion, MICP-inducing solution was applied three, four, and five times, respectively, according to the increasing organic matter content of the tested soils (i.e., 0.8% in sand, 1.4% in loamy sand, and 2.0% in loam). In the artificial rainfall test with a rainfall intensity of 33 mm/h and slope of 8.5°, the soil loss of the three field soils was successfully decreased, demonstrating 69, 82, and 56% in sand, loamy sand, and loam, respectively. Interestingly, Ca2+, an essential element of the MICP-inducing solution, primarily increased the Cu concentration of the soil solution by exchanging the soil-sorbed Cu, causing a higher MICP inhibitory effect. In this study, the composition of the MICP-inducing solution and the soil properties that could affect the formation of the bond by calcium carbonate precipitates were comprehensively understood based on the qualitative characteristics of individual calcium carbonate precipitates, the extent of bonding, and the strength of the soil. The results of this study confirmed the soil erosion prevention effect on the soils with various properties; further, the effect on the heavy metal-contaminated field soils indicates that MICP can be an effective measure to prevent soil erosion in heavy metals-contaminated sites for risk mitigation.