Gene expression characteristics of non-muscle invasive upper tract urothelial carcinoma

Abstract

서론: 요로상피암 (urothelial carcinoma)은 분자유전적으로 이질적인 다양한 아형으로 구성되어 있다. 대표적으로 기저형 (basal subtype)과 내강형 (luminal subtype)을 들 수 있으며 둘은 고유한 유전자 발현, 단백질 발현, 병태생리학적, 예후적, 그리고 임상적 특징을 보인다. 예를 들어, 기저형 근육침윤성 방광암 (muscle-invasive bladder carcinoma)은 다른 종류에 비교하여 불량한 예후를 보이고 항암화학요법에 이득을 볼 가능성이 높다고 알려져 있다. CK5/6, CD44, CK20와 같은 단백질 발현은 요로상피암의 분자 아형을 대표하는 표지자로 사용될 수 있다. 이에 반하여 기저형 단백질을 발현하는 비근육침윤성 방광암 (non-muscle invasive bladder carcinoma)은 오히려 좋은 예후를 보인다는 보고가 있으나 그 원인은 밝혀지지 않았다. 최근 근육침윤성 방광암의 분자유전학적 특성은 심도 있게 연구되고 있지만 비근육침윤성 상부요로상피암 (non-muscle invasive upper tract urothelial carcinoma)의 분자적 아형에 대해서는 알려진 바가 없다. 따라서 본 연구에서 유두형 비근육침윤성 상부요로상피암의 기저형과 내강형 단백질 발현에 따른 임상병리학적, 예후적, 분자적 차이에 대해 연구하였다.

방법: CK5/6, CD44, CK20에 대한 면역조직화학염색 (immunohistochemical staining)을 211명의 유두형 비근육침윤성 상부요로상피암환자의 조직 마이크로어레이 (tissue microarray)에 시행하였다 (예후연구군). 면역 염색은 음성, 양성, 그리고 정상패턴으로 분류하고 예후 차이를 연구하였다. 또한 CK5/6과 CK20의 면역염색결과에 따라 유두형 비근육침윤성 상부요로상피암을 구분하여 유전자 발현의 차이를 분석하였다 (유전자분석군). 구분한 방식은 다음과 같으며, 그룹 1 (고등급, 높은 CK5/6 및 낮은 CK20 발현), 그룹 2 (고등급, 높은 CK5/6 및 높은 CK20 발현), 그룹 3 (고등급, 낮은 CK5/6 및 높은 CK20 발현), 그룹 4 (저등급, 높은 CK5/6 및 낮은 CK20 발현), 그리고 그룹 5 (저등급, 높은 CK5/6 및 높은 CK20 발현)이다. P-cadherin, E-cadherin, 그리고 Ki-67에 대한 면역조직화학염색을 시행하여 고등급 유전자분석군의 유전자 발현 차이를 확인하였다.

결과: 우리는 CK5/6-음성, CD44-음성, 그리고 CK20-양성인 종양이 높은 등급 (CK5/6-음성, p <0.001; CD44-음성, p <0.001; CK20-양성, p = 0.017)과 잦은 방광내 재발 (CK5/6-음성, p = 0.002)과 연관된 고위험 종양이라는 것을 밝혔다. 카플란-마이어 분석을 통해 이 면역염색 결과는 더 짧은 암진행기간 (progression-free survival; CK5/6-음성, p = 0.001; CD44-음성, p = 0.009; CK20-양성, p = 0.031)과 더 짧은 암사망기간 (cancer-specific survival; CK5/6-음성, p = 0.009)을 가리킨다는 사실을 알았다. 게다가 음성의 CK5/6 염색은 짧은 암진행기간 (p = 0.009)과 암사망기간 (p = 0.045)에 대한 독립적 예후인자였으며 일치성지수 (Harrells concordance index)를 계산하였을 때 각각의 예후 예측을 유의하게 향상시켰다. 표지자를 함께 분석하였을 때 내강형과 유사한 발현 (CK5/6-음성/CK20-양성)을 보이는 경우 확연하게 불량한 예후를 보였다. 전사체 분석을 통해 고등급 유전자분석군사이에 308개의 차별발현유전자를 발견하였다. 이 유전자들은 세포접합과정 (cell adhesion)에 관여하며 그룹 1 과 2 에 비해서 그룹 3에 더 관여되는 것으로 나타났고 또한 세포 분열 관련 유전자도 그룹 3에 유의하게 높게 발현되었다. 그래서 이러한 기능의 변화가 그룹 3과 같은 종양의 나쁜 예후를 일으킬 수 있음을 제안하였다. 그룹 2는 mitogen-activated protein kinase (MAPK)와 tumor necrosis factor (TNF) 신호 전달 체계가 낮게 유지되는 것을 발견하였고 정상 요로상피와 유사한 면역염색형태를 보이는 점으로 미루어 보았을 때 악성화가 가장 덜 진행된 것으로 생각된다. 이에 비교하여 저등급 유전자분석군 (그룹 4와 5) 사이에서는 24개의 차별발현유전자를 발견하였고 이 유전자들은 cAMP-kinase (AMPK) 신호 전달 체계와 관련을 보였다. 또한 등급에 따른 유전자 발현 차이를 분석하였는데, 높은 CK5/6과 낮은 CK20발현을 보이는 종양에서 고등급 종양과 저등급 종양은 세포자멸 및 괴사자멸 (apoptosis/necroptosis)와 관련된 52개의 차별발현 유전자를 가지고 있었다. 반면에, CK5/6과 CK20이 둘 다 높은 종양의 경우에는 고등급과 저등급 종양 사이에 단 8개의 차별발현유전자만 발견되었다. 마지막으로, P-cadherin, E-cadherin, 그리고 Ki-67에 대한 면역염색 결과 CK5/6-음성 혹은 CK20-양성 유두형 비근육침윤성 상부요로상피암의 경우 비교적 높은 E-cadherin 발현과 유의하게 높은 Ki-67 활성도를 보였고 이를 통해 세포 접합과 분열에 관련된 특징을 재확인할 수 있었다. P-cadherin 발현의 경우 기저형 표지자로서 CK5/6 면역염색과 비슷한 결과를 보였다.

결론: CK5/6 과 CK20 면역조직화학염색을 통해 유두형 비근육침윤성 상부요로상피암을 예후에 따라 또한 유전자 및 표현형 발현에 따라 나눌 수 있다. 이 분류의 임상병리학적 특성은 비근육침윤성 방광암과 비슷하였고 이는 근육침윤성 방광암의 그것과는 상반된 것이어서, 초기 요로상피암의 CK5/6, CK20 발현은 근육침윤성 방광암에서 기존에 알려진 기저형, 내강형 분류법과는 구별되어야 할 것이다. 이 차이를 이해하는 것은 요로상피암의 진행에 따른 분자유전학적 발달 과정을 해석하는데 중요할 것이며 비근육침윤성 상부요로상피암 환자의 맞춤치료에 유용하게 사용될 수 있다.

Introduction: Urothelial carcinoma is a molecularly heterogeneous tumor that consists of various genetic subtypes. The basal and luminal subtypes, which are distinctly enriched in basal and luminal genes and proteins, are the two main clusters of these subtypes, showing a unique pathobiology, prognosis, and treatment response. For example, patients with basal type muscle-invasive bladder carcinoma (MIBC) have a poor prognosis and may benefit from chemotherapy more than patients with the other subtypes. The enrichment of CK5/6, CD44 and CK20 reflects the basal or luminal molecular subtype of urothelial carcinoma. In contrast, non-muscle invasive bladder carcinoma (NMIBC) is enriched in basal-like markers, and patients in some studies have shown a favorable prognosis for unknown reasons. Despite recent advances in the molecular landscape of MIBC, the genetic characteristics of subtypes of non-muscle invasive upper tract urothelial carcinoma (NMIUTUC) have not been studied. Therefore, we aimed to investigate the clinicopathological, prognostic, and transcriptional characteristics of papillary NMIUTUC associated with immunohistochemical (IHC) staining for basal and luminal markers.

Material and Methods: IHC staining for CK5/6, CD44, and CK20 was conducted on 211 patients with papillary NMIUTUC using a tissue microarray (prognosis cohort). Staining was classified as negative, positive or normal pattern, and its prognostic significance was analyzed. In addition, we characterized the gene expression profiles of subgroups of papillary NMIUTUC classified by IHC staining for CK5/6 and CK20 (GEP cohort) as follows: group 1 (high-grade CK5/6-high/CK20-low), group 2 (high-grade CK5/6-high/CK20-high), group 3 (high-grade CK5/6-low/CK20-high), group 4 (low-grade CK5/6-high/CK20-low), and group 5 (low-grade CK5/6-high/CK20-high). IHC staining for P-cadherin, E-cadherin, and Ki-67 was performed to validate the genetic alterations among the high-grade GEP cohorts.

Results: We found that CK5/6-negative, CD44-negative and CK20-positive tumors were distinctly high-risk subgroups that were associated with a high WHO grade (CK5/6-negative, p <0.001; CD44-negative, p <0.001; CK20-positive, p = 0.017) and frequent intravesical recurrence (CK5/6-negative, p = 0.002). Using Kaplan–Meier and log-rank tests, we found that these IHC subgroups were correlated with poor progression-free survival (CK5/6-negative, p = 0.001; CD44-negative, p = 0.009; CK20-positive, p = 0.031) and cancer-specific survival (CK5/6-negative, p = 0.009). Furthermore, CK5/6 negativity was identified as an independent prognostic factor for short progression-free survival (p = 0.009) and cancer-specific survival (p = 0.045). CK5/6 improved Harrells C-indices for progression-free (0.68 to 0.77, p = 0.029) and cancer-specific (0.59 to 0.77, p <0.001) survival. When these markers were combined, the luminal-like (CK5/6-negative/CK20-positive) subtypes showed distinctively poor prognoses. A transcriptional analysis revealed 308 differentially expressed genes (DEGs) across the high-grade GEP cohorts. Functional analyses of the genes identified cell adhesion as a common process differentially enriched in group 3 compared to groups 1 and 2. Furthermore, late cell cycle/proliferation signatures were also enriched in group 3 and in some of the other groups, which could explain the high-risk phenotype of group 3. Group 2, characterized by low levels of genes associated with mitogen-activated protein kinase and tumor necrosis factor signaling pathways, was hypothesized to represent the least cancerous subtype considering its normal urothelium-like IHC pattern. Compared to this, low-grade GEP subgroups 4 and 5 had 24 DEGs that were enriched in the cAMP-kinase pathway. Analyses of the grade-related genetic differences demonstrated that CK5/6-high/CK20-low tumors had 52 DEGs that indicated altered apoptosis/necroptosis between high- and low-grade tumors. On the other hand, CK5/6-high/CK20-high papillary NMIUTUC had as little as eight DEGs related to grade difference. Finally, IHC staining for P-cadherin, E-cadherin, and Ki-67 revealed that CK5/6-negative and/or CK20-positive papillary NMIUTUC had marginally stronger E-cadherin expression and a much higher Ki-67 proliferative index than the other immunophenotypes, which validated the enrichment of adhesion and late cell cycle/proliferation signatures, respectively. P-cadherin was reactive in a similar fashion to CK5/6 staining as a basal subtype marker.

Conclusion: IHC staining for CK5/6 and CK20 classified papillary NMIUTUC into subgroups relevant not only to their prognosis but also to genotypic-phenotypic traits. Clinicopathological characteristics of NMIUTUC relative to this stratification were shared by NMIBC but not by MIBC, suggesting that CK5/6 and CK20 expression in early urothelial carcinoma requires distinction from the conventional basal or luminal paradigm of MIBC. Luminal-like (CK5/6-high/CK20-low) papillary NMIUTUC was a distinct aggressive subtype that may be ascribed to altered adhesive and proliferative functions. Adhesion molecules or Ki-67 may be used as a prognostic biomarker complementary to CK5/6 and CK20. Understanding the genetic uniqueness of papillary NMIUTUC would aid in deciphering the genetic evolution of cancer progression and personalizing treatment for NMIUTUC.