Antitumor effects of MutT homolog 1 inhibitors in human bladder cancer cells

Abstract

Introduction: We investigated the antitumor effects and the possible molecular mechanisms of MutT homolog 1 (MTH1) inhibitors, TH588 or TH287, in cisplatin-sensitive (T24) and -resistant (T24R2) human bladder cancer cell lines.

Methods: Cell Counting Kit-8 (CCK-8) and clonogenic assays were performed to assess the anti-proliferative effect of TH588 or TH287 on T24 and T24R2 cells. The generation of reactive oxygen species (ROS) in T24 and T24R2 cells was evaluated with 2,7-dichlorofluorescein diacetate using the IncuCyte® ZOOM System. Flow cytometry was performed to analyze the changes in cell cycle and apoptosis. The expression of proteins related to apoptosis and cell cycle was determined by western blotting.

Results: The CCK-8 and clonogenic assays demonstrated the dose-dependent antitumor effects of TH588 or TH287 on T24 and T24R2 cells. Treatment with TH588 or TH287 increased the relative level of reactive oxygen species in both cell lines. MTH1 expression was not dependent on the treatment dose of TH588 or TH287. TH588 or TH287 treatment induced apoptosis via increased expression of fragmented poly (ADP-ribose) polymerase, caspase-3, -8, -9, and cytochrome c. Cell cycle arrest induced by TH588 or TH287 was accompanied by decreased expression of cyclin A.

Conclusions: Our results suggest that TH588 or TH287 may induce cancer cell suppression by off-target effects rather than MTH1 inhibition in cisplatin-sensitive and –resistant bladder cancer cells. Further investigations or clinical trials are needed to confirm the antitumor effects and underlying molecular mechanisms of MTH1 inhibitors in human bladder cancer cells.

서론: 인간 방광암 세포주에서 MutT homolog (MTH)1 inhibitor의 항암효과와 그 기전을 분자생물학적 수준에서 분석함으로써 전이성 방광암에 대한 새로운 항암 후보물질로서의 MTH1 inhibitor를 규명하고, 나아가 cisplatin 내성 방광암에 대한 2차 항암화학요법의 근간으로써 MTH1 inhibitor의 임상적 활용에 대한 기초자료를 확보하고자 하였다.

방법: 침윤성 방광암 세포주 T24와 cisplatin 내성 방광암 세포주 T24R2에 대한 MTH1 inhibitors (TH588, TH287)의 항암효과를 확인하기 위해 Cell Counting Kit-8 (CCK-8)과 클론원성 분석 (clonogenic assay)을 시행하였다. T24와 T24R2에 TH588또는 TH287을 용량별로 처리한 후 IncuCyte® ZOOM System을 이용하여 reactive oxygen species (ROS)의 발현을 분석하였다. TH588과 TH287 처리 후 T24와 T24R2의 세포주기 변화를 확인하기 위해 유세포 분석 (flow cytometry)을 시행하였고, 세포주기 및 세포고사 관련 단백질 발현의 변화를 측정하기 위해 Western blot을 시행하였다.

결과: CCK-8과 클론원성 분석 결과 TH588과 TH287은 T24와 T24R2에서 용량 의존적 항암 효과를 보여주었다. T24와 T24R2에 TH588 또는 TH287을 처리하였을 때, 두 세포주 모두에서 ROS가 증가하였다. 유세포 분석 결과 24시간 동안 TH588 또는 TH287을 처리하였을 때 T24와 T24R2 두 세포주에서 용량 의존적으로 G1 phase는 감소하였고, sub-G1과 G2/M phase는 증가하였다. Western blot 결과, MTH1 발현은 TH588 또는 TH287의 처리 용량에 의존하지 않았다. TH588 과 TH287은 fragmented poly (ADP-ribose) polymerase, caspase-3, -8, -9, cytochrome c의 발현을 증가시켜 세포사멸을 유도하였고, cyclin A의 발현 감소를 통해 세포주기 정지를 유도하였다.

결론: 본 연구결과 MTH1 inhibitor인 TH588과 TH287은 시스플라틴 민감성 및 내성 방광암 세포에서 MTH1억제가 아닌 표적 외 효과로 항암효과를 유도하였다. 그 기전을 확인하기 위한 추가 연구가 필요하다.