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Preclinical modeling of Osimertinib for Epidermal Growth Factor Receptor Exon 20 Insertion Mutant Non-Small Cell Lung Cancer
상피성장인자수용체 엑손 20 삽입 돌연변이 비소세포폐암 세포주에서 osimertinib 효능예측 연구

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Authors
이유수
Advisor
김동완
Issue Date
2020
Publisher
서울대학교 대학원
Description
학위논문(박사)--서울대학교 대학원 :의과대학 협동과정 종양생물학전공,2020. 2. 김동완.
Abstract
연구 목적: 상피 성장인자 수용체(Epidermal Growth Factor Receptor, EGFR) 엑손 20 삽입 돌연변이가 있는 비소세포폐암은 상피 성장인자 수용체 돌연변이 비소세포폐암에서 3번째로 높은 발병률을 보인다. 본 연구에서는 상피 성장인자 수용체 엑손 20 삽입 돌연변이의 전임상 모델들을 구축하고, 또한 해당 모델들에 대한 1, 2, 그리고 3세대 상피 성장인자 수용체 티로신 키나아제 억제제의 효능을 확인하고자 하였다.

연구 방법: 본 연구에서는 부위 유도 돌연변이 기법을 통하여 상피 성장인자 수용체 엑손 20 삽입 돌연변이인 A763insFQEA, V769insASV, D770insSVD, D770insNPG, P772insPR, H773insH, H773insNPH를 발현하는 Ba/F3 세포주 모델과, 또한 H773insAH 돌연변이를 가진 환자 유래 세포주 (SNU-3173)를 구축하였다. 해당 전임상 모델들을 사용하여 세포 생활력 분석법, 면역탁본 분석법, 그리고 N-Ethyl-N-nitrosourea (ENU) 돌연변이 유발 검사법을 진행하였고, 상피 성장인자 수용체 엑손 20 삽입 돌연변이 구조체와 3세대 상피 성장인자 수용체 티로신 키나아제 억제제인 osimertinib과의 결합 모델을 구축하고 비교하였다.

연구 결과: A763insFQEA 돌연변이를 제외한 상피 성장인자 수용체 엑손 20 삽입 돌연변이 세포들은 1세대 상피 성장인자 수용체 티로신 키나아제 억제제에 대하여 내성을 보였다 (IC50, 1.1±0.067 ~ 5.4±0.115 µM). 2세대 상피 성장인자 수용체 티로신 키나아제 억제제들은 대부분의 돌연변이들에 대하여 민감성을 보였지만 (IC50, 0.02±0.0002 ~ 161.8±18.7nM), H773insH 돌연변이는 비교적 덜 민감한 결과를 보였다 (IC50, 46.3±8.0 ~ 352.5±22.7nM). 2세대 상피 성장인자 수용체 티로신 키나아제 억제제의 야생형에 대한 돌연변이의 IC50비율은 3세대 티로신 키나아제 억제제들보다 높게 나타났다. 3세대 상피 성장인자 수용체 티로신 키나아제 억제제인 osimertinib은 H773insH 돌연변이를 포함하는 모든 상피 성장인자 수용체 엑손 20 삽입 돌연변이에 대하여 좋은 효과를 보였고 (IC50, 14.7 ~ 62.7nM), 야생형 상피 성장인자 수용체를 잘 보존할 수 있었다. 상피 성장인자 수용체 엑손 20 삽입 돌연변이 상동성 모형화와 도킹 모의실험을 통하여 osimertinib이 약제 결합 부위에 유연하게 결합하는 양상을 확인할 수 있었다. 또한, 상피 성장인자 수용체 엑손 20 삽입 돌연변이 Ba/F3 세포들에 대하여 ENU 돌연변이 유발 검사법을 진행한 결과, 상피 성장인자 수용체의 다양한 부위에서 돌연변이를 보였고, E762K, P794S, 그리고 G796D 돌연변이를 포함하는 엑손 20과 21에서 대부분 발생하였다. 더불어, 단계별 약제 농도 노출을 통한 osimertinib 내성 SNU-3173 세포주를 구축하였고, ENU 돌연변이 유발 검사법에서 발생한 상피 성장인자 수용체 E762K 돌연변이가 동일하게 확인되었다. 또한, 해당 돌연변이에 대한 기능적 연구를 통하여 상피 성장인자 수용체 티로신 키나아제 억제제의 내성기전으로 작용함을 확인하였다.

결론: Osimertinib은 상피 성장인자 수용체 엑손 20 삽입 돌연변이에 대하여 활성을 보이고, 약물 결합 부위에 유연하게 결합한다.
Introduction: Non-small cell lung cancer (NSCLC) with epidermal growth factor receptor (EGFR) exon 20 insertion mutations is the third most common type of EGFR-mutant NSCLC and is resistant to EGFR tyrosine kinase inhibitors (TKIs). This study was conducted to evaluate the efficacies of the 1st- to the 3rd-generation EGFR TKIs against NSCLC cells harboring EGFR exon 20 insertion mutations.

Methods: We developed seven EGFR exon 20 insertion-mutant Ba/F3 models using site-directed mutagenesis and one patient-derived NSCLC cell line (SNU-3173) of subtypes A763insFQEA, V769insASV, D770insSVD, D770insNPG, P772insPR, H773insH, H773insNPH, and H773insAH. Cell viability assays, immunoblotting, and N-Ethyl-N-nitrosourea (ENU) mutagenesis screenings were performed. EGFR exon 20 insertion-mutant structures and couplings with osimertinib, a 3rd-generation EGFR TKI, were modeled and compared.

Results: EGFR exon 20 insertion-mutant NSCLC cells, excluding EGFR A763insFQEA, were resistant to the 1st-generation EGFR TKIs (IC50, 1.1±0.067 to 5.4±0.115 µM). Mutants were sensitive to the 2nd-generation EGFR TKIs (IC50, 0.02±0.0002 to 161.8±18.7nM), except EGFR H773insH (IC50, 46.3±8.0 to 352.5±22.7nM). The IC50 ratios for mutant to wild-type cells were higher than those for the 3rd-generation EGFR TKIs. The 3rd-generation EGFR TKI osimertinib was highly potent against EGFR exon 20 insertion-mutant cells (IC50, 14.7 to 62.7nM), including EGFR H773insH, and spared wild-type EGFR cells. Flexible binding aspect of osimertinib to EGFR exon 20 insertion mutants was revealed through homology modeling and docking simulations. ENU mutagenesis screening of EGFR exon 20 insertion-mutant Ba/F3 cells showed various second sites for EGFR mutations, mostly in exons 20 and 21, including E762K, P794S, and G796D. In addition, osimertinib-resistant SNU-3173 cells were established by stepwise exposure to osimertinib and simultaneously harbored EGFR E762K mutation. In addition, functional studies of EGFR E762K mutation confirmed that this mutation acts as a resistant mechanism of EGFR TKIs.

Conclusions: Osimertinib is active against EGFR exon 20 insertion-mutant NSCLC and flexibly binds within drug-binding pockets.
Language
eng
URI
https://hdl.handle.net/10371/167787

http://dcollection.snu.ac.kr/common/orgView/000000158538
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Appears in Collections:
College of Medicine/School of Medicine (의과대학/대학원)Program in Cancer Biology (협동과정-종양생물학전공)Theses (Ph.D. / Sc.D._협동과정-종양생물학전공)
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