New Bioorganic Strategies for the Generation of Functional Molecular Structures on Specific Residues in Peptides and Proteins

Abstract

Labeling biomolecules with functional chemical molecules plays a major role in understanding complex life phenomena and has led to the development of bioimaging and biotherapeutics. In particular, fluorescent substances among the functional molecules were tagged on peptides and proteins to allow for the observation of intracellular biomolecules behavior in the field of bio-imaging and for identifying the location and course of disease in real time by non-surgical methods. In addition, functional molecules having a therapeutic effect such as anticancer drugs can be effectively conjugated to antibodies, and polymers such as polyethylene glycol are bound to proteins to stabilize structures and improve biological activity. The method widely used in the study of conjugating such functional molecules to biomolecules is to stably bind the two substances through selective bioconjugation with natural amino acids present in the biomaterial and to introduce non-natural amino acids into specific sites through genetic code to give bioorthogonal functionalization. A widely used method for bioconjugation to natural amino acids is to chemically target amino acid residues to form bonds. In particular, the amine group of the lysine is often used through a nucleophilic reaction. In order to selectively bind to the amine of the lysine, various chemical functional groups should be introduced into the substance to be conjugated, and therefore, the amine is treated with N-hydroxysuccinimide, isothiocyanate, isocyanate and imidoester. In addition, many methods are used to ligate through the reaction of cysteine thiol and maleimide. Nevertheless, since most lysine is present on the surface of most proteins, various products with different activities are produced after the reaction, and since cysteine is easily oxidized and most are present in proteins in the form of disulfide bonds, the reduction process is necessary before the reaction is performed. Therefore, it is meaningful to develop a method for selectively conjugating biomolecules with molecules having various functionalities. This doctoral dissertation involves 1) the formation of citrate-based fluorophore at the N-terminus of peptide and protein into de novo, and 2) the selective bioconjugation of tyrosine through sulfate-based reactions. The method of forming the 5-oxo-2,3-dihydro-5H-[1,3]thiazolo[3,2-a] pyridine-3,7-dicarboxylic acid fluorophore is a dehydration and condensation reaction of citrate and cysteine. In this reaction, citrate and cysteine become amide bonds that require large amounts of energy. For this reason, it was confirmed that the fluorophore was formed at the microwave method and at room temperature under peptide synthesis conditions by adding a coupling reagent that promotes amide bond formation. As a result, it was confirmed that a de novo fluorescent substance was formed under mild conditions using a citrate and a coupling reagent to introduce a cysteine-introduced peptide into the N-terminus. Furthermore, under a reaction condition through the use of a coupling reagent and citrate with N-terminal amino acids of proteins and peptides present in fixed cells and tissues, a fluorescent emission was confirmed by a confocal laser scanning microscope. Sulfate click reactions proceed through the exchange of hexavalent sulfur and fluorine. Conventional sulfate click reactions are known as reactions between aromatic fluorosulfates and aryl silyl ethers, but no sulfate click reactions have been performed by directly activating an aromatic hydroxyl anion without a silyl group using a base. Therefore, in this study, we developed a sulfate click reaction condition so that only the tyrosine selectively reacts among various amino acids with a fluorosulfate moiety. Under these reaction conditions, only the tyrosine present in the TAT 47-57 cell penetrating peptide was selectively conjugated. Fluorescent peptides can be treated in cells and fluorescence can be confirmed in the cells using a confocal laser scanning microscope. Furthermore, the polyethylene glycol polymer was conjugated on the 49th tyrosine exposed on the surface of the erythropoietin known as an anemia drug by a sulfate click reaction. After that, the proportion of the volume of erythrocytes in the blood increases when the conjugated protein is intravenously administered in vivo. In this study, the formation of selectively functional molecular structures in peptides and proteins with new bioorganic strategies is expected to be widely used in the field of chemical biology as well as contributing to the fields of bioimaging and biotherapeutics.

기능을 갖는 분자 를 이용하여 생체분자에 표시하는 것은 복잡한 생명현상을 이해 하고 설명하는데 중요한 역할을 하 고 바이오이미징과 생물치료학의 발전을 가져왔다 특히 기능성 분자 중 형광체는 펩타이드 및 단백질에 표시하 여 바이오이미징 분야에서 세포 내 생체분자의 거동을 관찰을 가능하게 하였고 비외과적인 방법으로 질병의 위치와 경과를 실시간으로 확인 할 수 있게 하였다 또한 생물치료학 분야에서 항암제와 같은 치료 효과를 갖는 기능성 분자 는 항체와 결합시켜 암세포만 선택 적으로 치료를 할 수 있으며 폴리에틸렌글리콜과 같은 기능성 고분자는 단백질에 결합하여 구조를 안정화하고 생물학적 활성을 향상시켜준다 이러한 기능성 분자 를 생체분자에 결합시키는 연구에 많이 사용되는 방법은 생체분자의 천연 아미노산과 선택적인 생체접합을 통해 두 물질이 안정하게 결합 하 는 것 과 유전 암호를 통해 비천연 아미노산을 특정 자리에 도입하여 결합하는 것이 있다 . 천연 아미노산에 생체접합을 하기 위한 방법 은 아미노산 곁사슬을 화학적인 표적으로 하여 결합을 형성하는 것이다 . 특히 , 라이신 아미노산의 아민 그룹과 친핵 반응을 통한 결합을 많이 이용한다 . 라이신의 아민과 선택적으로 결합하기 위해서는 결합 대상의 물질에 N 하이드록시숙신이미드,이소티오시아네이트, 이소시아네이트 그리고 이미도에스터 등 의 다양한 화학적 작용기를 도입하여 아민과 반응시킨다 . 그밖에 시스테인의 싸이올과 말레이미드의 반응을 통해 결합시키는 방법을 많이 사용되고 있다 하지만 대부분의 단백질에는 많은 라이신이 표면에 존재하기 때문에 반응 후에 활성이 다른 다양한 생성물이 만들어지는 문제점이 있고 시스테인의 경우 쉽게 산화되어 대부분이 디설파이드 결합 형태로 단백질에 존재 하기때문에 반응 전에 환원 과정이 필요하다 따라서,생체분자와 기능성 분자 를 선택적 으로 접합을 할 수 있는 방법을 개발하는 것은 의미가 있다 본 박사학위 논문은 1) 펩타이드와 단백질의 N 말단에 시트르산 염을 기반한 형광체를 드 노보로 형성 함과 2) 황산염 클릭 반응을 통한 타이로신의 선택적인 생체접합 개발을 포함한다 기존에 알려진 5 옥소 2,3 디하이드로 5H --[ 티아졸로 [3,2a 피리딘 3,7 디카복실산 형광체를 형성하는 방법은 고온에서 시트르산 염과 시스테인의 탈수 반응과 축합 반응이다 . 이 반응 과정에서시트르 산 염과 시스테인은 큰 에너지가 필요한 아마이드 결합을 하게된다 이러한 이유로 아마이드 결합 형성을 촉진시켜주는 커플링 시약을넣어줌으로써 펩타이드 합성조건에서 마이크로웨이브 방법과 상온에서도형광체가 형성됨을 확인하였다 . 이러한 결과로 N 말단에 시스테인을 도입한 펩타이드를 시트르 산 염과 커플링 시약을 사용하여 온화한 조건에서 드 노보로 형광체를 형성됨을 확인하였다 . 더 나아가 커플링 시약을 넣어주는 반응 조건으로 고정된 세포와 조직 안에 존재하는 단백질과 펩타이드의 N 말단 아미노산들과 시트르 산 염이 반응하여 형광체가 형성 됨을 공 초점 레이저 주사 현미경으로 확인하였다 황산염 클릭 반응은 6 가의 황과 불소의 교환을 통해 진행된다 . 기존의 황산염 클릭 반응은 방향족의 플루오르황산염과 아릴 실릴 에테르 사이의 반응으로 알려져 있지만 염기를 이용하여 실릴 그룹 없이 직접적으로 방향족 수산화 음이온으로 활성화시켜 황산염 클릭 반응을 한 사례가 없었다 . 따라서 본 연구에서는 다양한 아미노산 중에 타이로신에만 선택적으로 황산염 클릭 반응이 되도록 반응 조건을 개발하였다 . 이러한 반응 조건으 로 TAT 47 57 세포 투과성 펩타이드에 존재하는 타이로신에만 형광체를 선택적으로 생체접합 을 할 수 있었고 세포에 형광 펩타이드를 처리한 뒤 공초점 레이저 주사 현미경으로 세포 내 핵에서 형광을 확인하였 다 . 더 나아가 빈혈 치료제로 알려진 에리트로포이에틴 단백질 표면에 노출된 49 번 타이로신에 만 폴리에틸렌글리콜 고분자를 황산염 클릭 반응으로 생체접합을 하였다 . 동물실험을 통해서 고분자가 접합된 단백질을 생체 내로 투여 했을 때 혈액에서 적혈구가 차지하 는 용적의 비중이 증가함을 확인 하였다 본 연구 에서 새로운 생체유기 화학 전략 으로 펩타이드 및 단백질 내 에 선택적으로 기능성 분자 구조를 형성하는 것은 바이오이미징과 생물치료학 분야에 기여를 할 뿐 만 아니라 화학 생물학 영역에 도 광범위하게 사용될 것으로 예상한다