Studies on improving the efficacy of fish vaccines using a novel methodology: Antigen, administration, and delivery

Abstract

Control and prevention of disease is a high priority in aquaculture, and vaccination is important to prevent outbreaks. Here, poly(d,l-lactide-co-glycolic acid) (PLGA) microparticles (MPs) approximately 36 μm in diameter were used to encapsulate and deliver Aeromonas hydrophila formalin-killed cells (FKC) as an antigen, and the innate and adaptive immune responses of cyprinid loaches and common carp were assessed following vaccination. The antigen was confirmed to be well encapsulated by scanning electron microscopy analysis of PLGA MP sections. Blood and head kidney specimens were collected and analyzed for bacterial agglutination activity and relative mRNA expression of immune-related genes (IL-1β, IL-10, TNF-α, lysozyme C, TGF-β, and IgM) at 2, 4, 6, and 8 weeks post vaccination (wpv). For both fish species, the curve of antibody titer over time was shallower in the PLGA group than the FKC group. These titers in loaches and carp were very similar in the two vaccination groups until 8 and 6 wpv, respectively, but differences were subsequently noted in both species until the end of experiment. Loaches and carp were then challenged with A. hydrophila at 12 and 20 wpv, and 10 and 14 wpv, respectively, and relative survival rates were calculated. For both species, the PLGA groups demonstrated higher survival rates at all time points. Relative expression of IL-1β and TNF-α mRNA was significantly upregulated in the PLGA group at 2 and 4 wpv. Moreover, PLGA-MP vaccination increased relative mRNA levels of lysozyme C and IgM, which were significantly higher than those observed with FKC treatment at 2 wpv and 4, 6, and 8 wpv, respectively. In conclusion, PLGA-MP vaccines have the potential to induce longer and more potent immune responses than FKCs alone, and protect both cyprinid loaches and common carp with greater efficiency. Over the last 50 years, various approaches have been established for the development of antigens for immunostimulation. We used phage lysate (PL), composed of inactivated antigens by the lytic bacteriophage pAh 6-c for A. hydrophila JUNAH strain to develop a vaccine for the prevention of A. hydrophila infection in Cyprinus carpio (common carp). We also assessed the poly D,L lactide-co-glycolic acid (PLGA) microparticles encapsulation method to increase the efficiency of the vaccine. Six groups of vaccines involving encapsulated by PLGA, formalin killed cells, or phage lysate at low or high concentration were prepared for intraperitoneal injection in C. carpio. Blood specimens and head kidney samples were collected at various time points for bacterial agglutination assay and to assess relative expression of immune-related genes interleukin-1 beta (IL-1β), tumor necrosis factor alpha (TNF-α), lysozyme C, and serum amyloid A (SAA). The vaccine groups using high dose phage lysate antigen showed significantly higher agglutination titers than all other groups at 4- and 6-weeks post vaccination (wpv), with the titer of the PLGA encapsulated vaccine group being highest from 10 wpv to the end of the experiment. The survival rate of fish immunized with the phage lysate vaccines were higher than that of fish immunized with the formailin killed cells vaccine in the challenge experiment conducted 6 wpv. Additionally, the PLGA-encapsulated high dose phage lysate antigen vaccinated groups showed the best protective efficacy in the challenge experiment 12 wpv. Vaccines using the phage lysate antigen also showed higher IL-1β and lysozyme C gene expression at 7 days post vaccination (dpv) and 2 wpv, and higher TNF-α gene expression was seen at 7 dpv. Higher SAA gene expression was seen in these groups at 1 dpv. These results suggest that phage lysate antigen has the potential to induce robust immune responses than formalin killed cells-based vaccines, and could be more effective as a novel inactivated antigen in preventing A. hydrophila infection in C. carpio. Immunization by bath immersion is likely the simplest method of fish vaccination. Although the route of immunogenicity has not been fully identified, immersion vaccination is clearly a useful labor-saving technique. In this study, microbubble (MB) treatment was assessed for its ability to improve the efficacy of bath immersion vaccination in the cyprinid loach. MBs are commonly defined as minute particles of gas with a diameter of less than 100 μm, which generated free radicals. Here, the efficacy of MB treatment for vaccination enhancement in the cyprinid loach was assessed in direct challenge experiments using the virulent A. hydrophila JUNAH strain; assessments comprised agglutination titer assay and non-specific parameter analysis. Agglutination titers were high in loaches that were immunized via injection with inactivated cells (FKC group); however, non-specific immune activation parameters (e.g., lysozyme, superoxide dismutase, and phagocytic activity) were more increased in loaches that were immunized via bath immersion with MB treatment. Moreover, MB-treated loaches showed comparable survival rates, relative to loaches immunized via injection with formalin inactivated cells. Thus, higher levels of non-specific immune parameters suggest increased efficacy of this vaccine approach. Improving the effectiveness of bath immersion vaccine will increase its affordability and ease of application in aquaculture. In this study, the methods of encapsulating antigen with a biodegradable material, strengthening immersion vaccines, and use of novel antigen were applied to enhance the effectiveness of fish vaccines against A. hydrophila infection. The efficacy of the methods used in this study was verified through analysis of adaptive and innate immunity and performing a challenge experiment compared to the FKC vaccine, and excellent results were achieved. Therefore, these methods will be useful to prevent diseases caused by fish pathogens. We should attempt to develop better vaccines, considering the rising economy in aquaculture and public health of consumers.

수산업에서 질병의 제어와 예방 아주 높은 우선순위를 가지며, 백신은 이 질병의 발생을 예방할 중요한 수단이다. 여기서, 대략 36 마이크로미터 크기의 poly(d,l-lactide-co-glycolic acid) (PLGA) microparticles (MPs)을 사 용하여 Aeromonas hydrophila formalin-killed cells (FKC)을 항원으로 캡슐화 하였으며, 미꾸라지와 잉어에서 선천 및 적응 면역 반응을 평가하였다. PLGA MP 절편의 주사 전자 현미경 분석을 통해 항원은 잘 캡슐화 된 것을 확인 하였다. IL-1β, IL-10, TNF-α, lysozyme C, TGF-β, 그리고 IgM의 면역 관련 유전자의 상대적 mRNA 발현과 세균 응집 활성의 분석을 위 해 혈액 및 두신 샘플을 수집하였다. 두 어종 모두에서 항체 역가 곡선 은 PLGA 그룹이 FKC 그룹보다 완만하였다. 미꾸라지와 잉어의 항체 역가는 각각 8주와 6주를 기점으로 실험 종료에 가까워질수록 FKC 그룹과의 차이가 벌어지기 시작하였다. 이후 두 어종은 각각 12주와 20주 그리고 10주와 14주에 A. hydrophila 균주를 공격접종 하였으며, 상대 생존률을 계산하였다. 두 종 모두에서 PLGA 그룹이 모든 실험 시점에서 높은 생존률이 나타났다. IL-1β와 TNF-α의 mRNA는 PLGA 그룹에서 2주와 4주에 유의미하게 상향 조절되었다. 더욱이 PLGA-MP 백신접종은 lysozyme C와 IgM의 mRNA 유전자 발현량이 각각 2주와 4주 그리고 6주와 8주에서 유의미하게 높게 나타나는 것을 확인하였다. 결론적으로 PLGA MP 백신은 FKC 백신보다 더 길고 강한 면역 반응을 유도할 가능성이 있으며, 미꾸라지와 잉어의 질병을 예방하는데 큰 효과가 있을 것으로 보인다. 지난 50년 동안 면역자극을 위한 항원의 개발을 위해 다양한 접근법 들이 만들어져 왔다. 우리는 A. hydrophila JUNAH의 용해성 박테리오파아지인 pAh 6-c를 이용하여 불활화한 항원으로 구성되어 있는 파아지 용해물을 사용하여 잉어에서 A. hydrophila 감염을 예방하는 백신을 개발하고자 하였다. 앞선 연구에서 사용된 PLGA를 이용하여 항원을 캡슐화하여 백신으로 사용하였으며, 이를 선천면역과 적응면역 반응을 측정하여 효과를 평가하였다. 항체 역가 실험에서는 PLGA를 사용한 그룹이 캡슐화 없이 단독의 항원인 FKC나 phage lysate를 사용한 그룹보다 높은 항체가를 보여 주었다. 그러나 같은 PLGA 그룹 내에서도 phage lysate를 사용한 그룹이 FKC를 캡슐화한 그룹보다 높은 항체가를 나타내었다. TNF-α, IL1β, lysozyme C, 그리고 SAA의 유전자 발현 또한 PLGA 그룹이 높은 발현량을 보였으며, phage lysate를 사용한 그룹이 더 높은 발현량을 보였다. 이러한 결과는 종합적으로 phage lysate가 FKC 보다 강도 높은 면역 반응을 유도할 잠재력이 있음을 보여준다. 침지법을 통한 면역강화는 어류 백신접종법 중 가장 쉬운 방법으로 보인다. 면역원성을 제공하는 경로가 아직 완전히 밝혀지지는 않았음에도 침지 백신법은 노동력 절감을 위한 아주 용이한 방법임에는 틀림이 없다. 본 연구에서는 마이크로버블 처리가 잉어에서 침지 백신의 효율을 증가시키는 능역이 있음을 평가하고자 한다. 마이크로버블은 약 100 마이 크로미터 미만의 직경을 가지는 작은 가스 입자로 정의하고는 한다. 여기서는 백신의 효율 증진을 위한 마이크로버블 처리의 효율을 잉어에서 항체가와 면역인자 분석을 통해 평가하고자 한다. 항체가에서는 FKC를 복강 주사한 그룹이 침지 그룹들 보다 높게 나타났지만, lysozyme, superoxide dismutase, 그리고 phagocytosis 활성은 오히려 마이크로버블을 처리한 침지그룹에서 더 증가하는 것을 확인 하였다. 더욱이 마이크로버블 처리 그룹의 미꾸라지는 FKC 주사 그룹과 비교했을 때 비슷한 생존율을 보였다. 비특이성 면역 파라미터의 높은 수준은 이 백신법이 효력 증가를 시킬 수 있음을 보여준다. 지금까지의 연구들에서 생분해성 물질을 이용한 항원의 캡슐화 방법, 침지 백신의 효과 증진을 위한 방법, 새로운 항원의 적용을 통해 A. hydrophila 감염에 대한 어류백신의 효과를 향상시키고자 하였다. 본 연구에서 사용된 방법론들은 선천 면역과 적응 면역 반응의 분석과 공격실험을 통해서 기존의 FKC 백신과 비교하고자 하였으며, 훌륭한 결과를 보여주었다. 그러므로 이 방법론들은 어류 질병의 예방을 위해 가치가 있을 것으로 보인다. 앞으로 우리는 수산업이라는 특성을 고려한 더 나은 백신의 개발과 공중 보건을 위해 노력해야 할 것이다.