The roles of redox homeostasis in prostate cancer depending on the stages of cancer and levels of oxidative stress

Abstract

전립선 암은 선진국 남성에서 가장 많이 진단된 비-피부암이며 암 관련 사망의 주요 원인이다. 전립선 암은 연령과 관련이 있으며, 연령에 따라 증가하는 활성산소 (ROS)와 관련된 신호 경로는 암의 발달과 진행에 중요한 역할을 한다. 활성산소는 세포 증식, 침습 및 전이를 촉진하는 한편, 세포자멸사를 억제하여 암 진행을 초래한다. 그에 따라, 항산화 효과에 기반한 항암제들이 보고되었다. 그러나, 더 높은 수준의 활성산소는 세포주기 정지, 세포자멸사 및 괴사를 유발하여 암을 억제한다. 전립선 암에서 활성산소의 역할에 대해서는 아직 많이 알려져 있지 않다. 제1장의 연구에서, 폴리페놀의 일종인 phloretin은 산화 스트레스를 유발하여 전립선 암 세포 PC3와 DU145를 억제했다. 이 연구에서 전립선 암 세포 PC3와 DU145에서 phloretin을 처리한 후 암 세포의 증식, 집락 형성 및 세포 이동의 변화를 확인했다. 활성산소와 관련된 유전자 발현 양의 변화를 측정하였다. phloretin은 활성산소를 증가시키고 두 세포주 모두에서 세포 증식, 집락 형성, 세포 이동을 억제하였다. 또한, phloretin을 처리하자, 항산화 효소 (Catalase, SOD2, Gpx1, Gpx3)의 유전자 발현 량이 감소하면서, 산화 스트레스를 증가시켰다. 또한, 위 유전자들의 조절 인자 CISD2의 발현도 감소되었다. 또한, 증가한 활성산소는 Wnt/β-catenin 신호 전달 경로 (β-catenin, TCF4, FoxA2, c-Myc) 및 Twist1의 유전자 발현 량을 상당히 감소시킨 것을 발견하였다. 따라서, phloretin은 Wnt/β-catenin 신호에 영향을 주는 활성산소를 생성하여 암을 억제한다. 이 연구의 결과에 따르면, phloretin은 in vitro 상에서 전립선 암에 치료 효과가 있어 암 세포주 PC3 및 DU145의 증식 및 이동을 억제하였다. Phloretin의 메커니즘은 활성산소의 생산에 기인하는 것으로 생각된다. 유망한 항암제로서 phloretin의 가능성을 확인하였다. 제2장에서는 이미 다른 목적으로 승인된 약물의 항암 능력을 평가하여 새로운 약물을 발견하기 위한 약물 용도 변경에 중점을 두었다. 제2장은 FDA의 승인을 받은 항정신병약인 pimozide가 전립선 암에서 산화 스트레스를 유도함으로써 in vitro 및 in vivo에서 전립선 암을 억제하는 것을 보고했다. Pimozide를 전립선 암 세포, PC3와 DU145에 처치 후, 세포 증식, 집락 형성, 세포 이동, 활성산소 생산 및 항 산화 스트레스 관련 유전자의 발현량을 조사했다. 또한, 전립선 암이 있는 유전자변형 마우스인 TRAMP에 pimozide를 투여 후 조직병리학적 분석, 활성산소 생성 및 SOD 활성 분석을 하였다. Pimozide는 두 세포주 모두에서 활성산소 생성을 증가시켰으며 세포 증식, 집락 형성, 세포 이동을 억제했다. Pimozide에 의해 유도된 산화 스트레스는 항산화 효소 (SOD1, Prdx6, Gpx2) 및 CISD2의 발현을 변화시켰다. 항산화 물질인 GSH를 같이 처리하자 pimozide로 유도된 활성산소의 양이 감소했으며, 세포 증식의 억제가 감소하였다. TRAMP 마우스에 pimozide를 투여하자, 활성산소 생성이 증가하고 SOD 활성이 감소하면서 전립선 암의 진행을 감소시켰다. 위의 결과는 항정신병 약물인 pimozide가 in vitro 및 in vivo 상에서 전립선 암을 억제한다는 것을 시사한다. Pimozide의 메커니즘은 활성산소 생성 증가와 관련이 있을 수 있으며, pimozide는 유망한 항암제로서의 가능성이 있다. 제1장과 제2장은 항암 효과를 지닌 물질이 전립선 암 세포와 TRAMP 마우스에서 산화 스트레스를 유발하여 전립선 암을 억제한다고 보고하였다. 제3장에서는 선천적으로 손상된 산화환원항상성이 유전자 변형 마우스에서 전립선 암의 전암 단계에 어떤 영향을 미치는지 연구했다. Glutathione peroxidase 3 (GPX3)는 산화 스트레스로부터 세포를 보호하고 인간 전립선 암에 발현이 감소한다고 보고되었다. 우리는 이전에 Gpx3의 감소가 TRAMP 마우스에서 전립선 암을 증가시키는 것을 확인하였고 Gpx3가 전립선의 전암 단계인 prostatic Intraepithelial neoplasia (PIN)의 발달에 중요한 역할을 할 수 있다고 가정했다. 이중 녹아웃 마우스 Nkx3.1-/-; Gpx3+/+, Nkx3.1-/-; Gpx3+/- 및 Nkx3.1-/-; Gpx3-/-가 생산되었다. 무작위로 그룹을 나눈 동물을 4, 8, 12개월에 안락사 후 체중과 비뇨생식관 (GUT) 무게를 측정하였다. 전립선에서 산화 스트레스 및 Wnt 신호 전달과 관련된 유전자의 발현을 분석하였다. 또한 병리조직학적 분석과 활성산소 및 SOD 활성을 측정하였다.. Gpx3의 발현 량의 감소는 Nkx3.1 녹아웃 마우스에서 체중 및 비뇨생식관 중량에 유의미한 영향을 미치지 않았다. 산화 스트레스와 관련된 Sod3, Nos2, Hmox, Cisd2의 mRNA 발현은 4개월령 Nkx3.1-/-; Gpx3-/- 마우스에서 유의하게 증가하였으나, 8개월과 12개월에서는 유의적으로 감소하였다. Wnt 신호 전달과 관련된 Ctnnb1 및 하위 신호에는 유의미한 변화가 없었다. 12개월령 Nkx3.1-/-; Gpx3-/- 마우스에서 증가한 ROS와 감소한 SOD 활성이 관찰되었다. Gpx3 녹아웃 마우스에서 조직병리학적 점수와 상피세포의 두께가 증가하였고 전립선의 내강 면적이 감소하였다. 이번 실험의 결과는 항산화 효소인 Gpx3가 전립선의 초기 전암 단계인 PIN에서 전립선 세포의 증식을 억제하는 역할을 한다는 것을 in vivo 상에서 처음으로 보고하였다. 전립선 암에서 산화환원항상성의 역할은 암의 단계와 산화 스트레스 수준에 따라 다를 수 있다. 나는 전립선 암 세포주, TRAMP 마우스, Nkx3.1; Gpx3 녹아웃 마우스에 산화 스트레스를 유발하여 변화를 관찰하였다. Phloretin과 pimozide는 암세포와 TRAMP 마우스에서 산화 스트레스를 유발하여 암을 억제하는 것을 보여주었다. 그와 반대로, Nkx3.1; Gpx3 녹아웃 마우스의 전암 단계에선 산화 스트레스가 암으로의 진행을 촉진하는 것을 확인하였다. 산화환원항상성의 역할을 이해하고 접근하기 위해서는 암의 맥락을 이해하는 것이 필요하다. 전립선 암의 생물학적, 생리학적, 병리학적 특징을 이해하고 새로운 항암 신약 개발 전략을 위해선 산화환원항상성의 역할을 이해하는 것이 중요하다.

Prostate cancer is the most diagnosed non-skin cancer in men in developed countries and is a leading cause of cancer-related deaths. Prostate cancer is closely related to age, and several signaling pathways involving reactive oxygen species (ROS), which increase with age, play important roles in the development and progression of cancer. In general, ROS promote cell proliferation, invasion, and metastasis, while inhibiting apoptosis, leading to cancer progression. Therefore, anticancer agents have been reported based on antioxidant effects. However, higher levels of ROS have anti-cancer effects, by causing cell cycle arrest, apoptosis, and necrosis. There is still much to be known about the role of ROS in prostate cancer. A study in Chapter I reported that phloretin, a polyphenol, induces oxidative stress to inhibit prostate cancer cells, PC3 and DU145. In this study, changes in proliferation, colony formation, and migration after phloretin treatment in human prostate cancer cells PC3 and DU145 were examined. ROS and gene expression were measured. Phloretin increased ROS and suppressed cell proliferation, migration, and colony formation in both cell lines. Additionally, phloretin treatment increased oxidative stress, as demonstrated through lower antioxidant enzymes (catalase, SOD2, Gpx1, Gpx3). In addition, their regulator CISD2 decreased in expression. We also found that increased ROS significantly downregulated multiple components of the Wnt/β-catenin signaling pathway (β-catenin, TCF4, FoxA2, c-Myc) and Twist1. Thus, anticancer activity of phloretin against human prostate cancer cells occurs through generating ROS to influence Wnt/β-catenin signaling. The results of this study suggest that phloretin has a therapeutic effect on prostate cancer in vitro, inhibiting the proliferation and migration of cancer cell lines PC3 and DU145. The mechanism of phloretin appears to be increasing ROS production. I recommend phloretin as a promising anticancer therapeutic agent. Chapter II focuses on drug repurposing to evaluate the anticancer capacity of drugs that have already been approved for other purposes, as a way to discover new drugs. Chapter II reported that the FDA-approved antipsychotic drug, pimozide, inhibits prostate cancer in vitro and in vivo by inducing oxidative stress in prostate cancer. We examined cell proliferation, colony formation, migration, ROS production, and the expression of antioxidant-related genes after treatment of human prostate cancer PC3 and DU145 cells with pimozide. In addition, histopathology, ROS production, and SOD activity were analyzed after administering pimozide to TRAMP, a transgenic mouse with prostate cancer. Pimozide increased the generation of ROS in both cell lines and inhibited cell proliferation, migration, and colony formation. Oxidative stress induced by pimozide caused changes in the expression of antioxidant enzymes (SOD1, Prdx6, and Gpx2) and CISD2. Co-treatment with glutathione, an antioxidant, reduced pimozide-induced ROS levels and counteracted the inhibition of cell proliferation. Administration of pimozide to TRAMP mice reduced the progression of prostate cancer with increased ROS generation and decreased SOD activity. These results suggest that the antipsychotic drug, pimozide, has beneficial effects in prostate cancer in vivo and in vitro. The mechanism of pimozide may be related to augmenting ROS generation. We recommend pimozide as a promising anticancer agent. Chapters I and II reported that anticancer agents suppress prostate cancer by oxidative stress, with prostate cancer cells and TRAMP mice. Chapter III studied how inherently broken redox homeostasis affects precancerous stage of prostate cancer with genetically modified mice. Glutathione peroxidase 3 (GPX3) protects cells from oxidative stress and its reduced expression in human prostate cancer specimens has been reported. We previously reported that down-regulation of Gpx3 increased prostate cancer in TRAMP mice. We hypothesized that Gpx3 might play an important role in the development of prostatic intraepithelial neoplasia (PIN), a pre-cancer stage of the prostate. The double-knockout mice Nkx3.1-/-; Gpx3+/+, Nkx3.1-/-; Gpx3+/-, and Nkx3.1-/-; Gpx3-/- were produced. Randomly divided animals were weighed and genitourinary tract (GUT) weights were measured after euthanasia at 4, 8 and 12 months. The mRNA expression of genes related to oxidative stress and Wnt signaling was analyzed in the prostate. In addition, histopathology, ROS and SOD activities were measured. Down-regulation of Gpx3 did not significantly affect body weight and GUT weight in Nkx3.1 knockout mice. The mRNA expression of Sod3, Nos, Hmox, and Cisd2, which were associated with oxidative stress, were significantly increased in Nkx3.1-/-; Gpx3-/- mice at 4 months of age, but significantly decreased at 8 months and 12 months. There was no significant change in β-catenin and its target signals associated with Wnt signaling. Increased ROS and decreased SOD activity were observed in Nkx3.1-/-; Gpx3-/- mice at 12 months of age. The histopathologic score and epithelium thickness were increased and lumen area was decreased in Gpx3 KO mice. The results report for the first time that the antioxidant enzyme Gpx3 plays a role in inhibiting hyperplasia in the early precancerous PIN stage of the prostate gland in vivo. The roles of redox homeostasis in prostate cancer may depend on the stages of the cancer and the levels of oxidative stress. I observed changes in prostate cancer cell lines, TRAMP mice, and Nkx3.1; Gpx3 KO mice by inducing oxidative stress, respectively. The treatment of phloretin and pimozide in cancer cell lines or TRAMP mice has been shown to inhibit cancer with oxidative stress. On the contrary, it was confirmed that oxidative stress promoted progression to cancer at the precancerous stage in Nkx3.1; Gpx3 KO mice. It is necessary to identify and access the roles of redox homeostasis according to the context of cancer. In this dissertation, I suggest that redox homeostasis of prostate cancer is an important target in understanding the biological, physiological and pathological characteristics of prostate cancer and in developing new anticancer strategies.