Anti-tumor Effects of the Tyrosine Kinase Inhibitor Rivoceranib in Canine Melanoma and Mammary Gland Tumor

Abstract

암은 반려견의 주요 사망원인 중의 하나로 10세령 이상의 개의 50% 이상에서 적어도 1가지 이상의 악성 종양에 거리는 것으로 알려져 있으며 (London et al., 2003), 미국에서는 암이 2세 이상의 개에서는 사망의 원인이 되는 것으로 보고되었다 (Stephens et al., 2019) 이렇듯 개에서 암이 빈번히 발생하고 죽음의 원인되는 상황을 고려할 때 인의 및 수의학에서, 표준 요법에 반응하지 않는 종양에 대해 치료 반응을 보이는 novel한 항종양 악물이 시급이 요구되는 상황이다. (Rutteman et al., 2013). Tyrosine kinase는 tyrosine residue의 다른 단백질을 인산화 시키는 단밸질로 세포 성장과 분화 조절에 긴밀하게 작용하는 정상 세포 신호 전달 체계에서 중요한 역할을 한다. VEGFR은 혈관 내피세포에서 발현하며, VEGF-VEGFR 상호작용은 내피세포의 이주와 증식에 중요한 역할을 한다. (Thurston G et al., 2004). PDGF와 PDGFR은 기질과 pericyte에서 발현되며, PDGF는 혈관신생을 촉진할 수 있다. (London., 2009, Cherrington JM et al., 2000, McCarty MF et al., 2003). Angiogenesis는 악성 종양 연구에서 major scientific interest의 주제로 생각되고 있다. 최근 anti-angiogenic small molecule receptor tyrosine kinase inhibitors (TKIs) 등을 포함한 여러 혈관신생 타겟의 약물이 다양한 carcinoma에서 성공을 거두고 있다. (Qin et al., 2019) 이렇듯 사람의 종양 연구에서는 tyrosine kinase의 이상에 대한 연구가 많이 진행되어 있으나, 수의 종양학에서는 연구가 비교적 덜 되어 있는 상황이다. (London., 2009). Rivoceranib은 VEGFR2 inhibitor로 암세포의 microtubule을 타겟하여 항종양 효과를 발휘한다. 최근에 사람 암환자에서 종양의 개선효과가 있음이 보고되었다. 이에 본 연구는 rivoceranib의 in vitro 및 in vivo 실험을 통해 개의 흑색종 (LMeC) 및 유선종양 (CHMp) 세포에서의 항암 효과를 확인하고자 진행하였다. 세포독성 평가 결과 약물 48h 적용시 LMeC 및 CHMp에서 각각 6.25, 12.5uM부터 나타나기 시작했다. 또한 약물 처리 농도의 증가에 따라 세포성장이 감소하는 양상을 확인할 수 있었다. 이러한 성장 억제 및 세포독성에 대한 기전 확인을 위하여 세포주기분석 (Cell cycle analysis), 세포사멸분석 (Cell apoptosis analysis) 및 단백질발현 (Western blot) 분석을 진행하였으며, 그 결과 주로 암세포주의 G1기 arrest를 통한 세포 분열 억제, 사멸 및 괴사세포의 증가 및 VEGFR2 단백질 활성 억제를 통해 해당 세포독성 효과가 나타나는 것으로 확인되었다. 또한 LMeC 및 CHMp가 이식된 마우스 종양모델을 이용하여 xenograft 실험을 진행하였으며, Rivoceranib을 75, 150 및 300mg/kg로 LMeC 모델에서는 28일간, CHMp 모델에서는 15일간 각각 일일 1회 경구투여 하였다. 그 결과 LMeC 모델에서는 150mg/kg 및 300mg/kg 투여 그룹에서 vehicle 그룹 대비 유의적인 종양 크기 감소가 확인되었으며, CHMp 모델에서는 모든 용량에서 vehicle 그룹 대비 종양의 크기가 유의적으로 감소하였다. 또한 부검 시 적출한 종양의 무게 측정에서도 투여된 약물의 농도 의존적으로 종양 무게가 감소된 것을 확인하였다. 또한 부검 시 적출한 종양조직의 분석 결과 역시 RIVOCERANIB은 세포 사멸 유도, 세포분열 억제, 종양 혈관화 능력을 억제함을 확인할 수 있었다. 본 시험은 개의 melanoma와 mammary gland tumor에 대해 Tyrosine Kinase Inhibitor인 Rivoceranib의 항암 치료 효과를 처음으로 진행한 연구이며, 본 결과를 통해 개의 종양 환자에서 Rivoceranib을 항암제로 적용해볼 수 있는 가능성이 확인되었다.

Cancer is one of the leading causes of death in dogs, and more than 50% of dogs over 10 years of age will develop at least one malignant tumor (London et al., 2003). In the United States, it has been reported that cancer is one of the leading causes of death in dogs over 2 years of age (Stephens et al., 2019). As cancer occurs so frequently in dogs, often causing death, there is an urgent need for novel anti-tumor drugs for tumors that do not respond to the current standard therapies in human and veterinary medicine (Rutteman et al., 2013). Tyrosine kinase is a protein that phosphorylates other proteins via their tyrosine residues and plays an important role in the normal cell signaling network which is closely involved in cell growth and differentiation. Vascular endothelial growth factor receptor (VEGFR) is expressed in vascular endothelial cells, and the VEGF-VEGFR interaction plays an important role in the migration and proliferation of endothelial cells (Thurston G et al., 2004). Platelet derived growth factor (PDGF) can promote angiogenesis, additionally PDGF as well as Platelet derived growth factor receptor (PDGFR) are expressed by the stroma and pericytes (London., 2009, Cherrington JM et al., 2000, McCarty MF et al., 2003). Angiogenesis is considered a topic of major scientific interest in malignant tumor research. Recently, several angiogenic drugs, including anti-angiogenic small molecule receptor tyrosine kinase inhibitors (TKIs), have demonstrated success in treating various carcinomas (Qin et al., 2019). The studies mentioned above were conducted on tyrosine kinase abnormalities in human tumor research, but less research has been conducted in veterinary oncology (London., 2009). Rivoceranib is a VEGFR2 inhibitor that targets microtubules in cancer cells thereby exerting antitumor effects, and has been reported to improve in human cancer patients. Thus, the aim of this study was to determine the anticancer effect of rivoceranib on canine melanoma cells (LMeC) and mammary tumor cells (CHMp) both in vitro and in vivo. Cytotoxicity tests showed changes after 48h of drug treatment, at 6.25 and 12.5 µM in LMec and CHMp, respectively. In addition, cell growth decreased with increasing drug concentrations. Cell cycle analysis, cell apoptosis analysis, and western blot were conducted to investigate the mechanism of growth inhibition and cytotoxicity. As a result, the cytotoxic effects were primarily due to inhibition of cellular division through arrest of the G1 phase of the cancer cell lines, increased cell death and necrotic cells, and inhibition of VEGFR2 protein activity. In addition, xenograft experiments were performed using a mouse tumor model implanted with LMeC and CHMp. Rivoceranib was administered orally once a day at 75, 150 and 300 mg/kg for 28 days in LMeC xenograft models and for 15 days in CHMp xenograft models. The LMeC xenograft model showed a significant decrease in tumor volume in the 150 mg/kg and 300 mg/kg treated groups compared to the vehicle control. The CHMp model showed significant decrease in tumor volume in all drug administered groups compared to the vehicle control. In addition, the weight of tumors extracted at necropsy were decreased with increasing drug concentrations. The analysis of tumor tissues extracted at necropsy showed that Rivoceranib inhibited induction of apoptosis, inhibited cellular division and tumor vascularization. This study is the first to look at the anticancer effect of Rivoceranib, a tyrosine kinase inhibitor, on canine melanoma and mammary gland tumors, and the results confirm the potential of Rivoceranib as an anticancer agent in canine tumor patients.