The Functional Role of NEDD4 in Proliferation and Differentiation of Bone Marrow-Derived Mesenchymal Stem Cells

Abstract

NEDD4 (Neural precursor cell expressed developmentally downregulated protein 4)는 E3 유비퀴틴 리가아제로서 타겟 기질 단백질에 유비퀴틴을 결합시킨다. NEDD4의 역할은 여러가지 다양한 세포내 신호전달경로에 관여하여 여러 종류의 암이 생기거나 증식하는 것을 조절하는 것으로 널리 알려져 있다. 그러나, 골수유래 중간엽 줄기세포 내에서 NEDD4 단백질의 역할은 여전히 밝혀지지 않은 부분이 많다. 이 논문에서는 중간엽 줄기세포에서 조골세포로 분화하는 과정에서 NEDD4가 조골세포의 생장과 분화에 미치는 영향과 외부적 산화 스트레스에 의해 유도되는 세포사멸을 NEDD4가 어떻게 막을 수 있는지 그 기전을 연구하였다. 1장에서는 NEDD4가 TGFβ1/BMP2 신호전달 경로를 조절하여 골수유래 중간엽 줄기세포에서 조골세포로 분화될 때 어떤 기능을 하는지 알아보고자 하였다. 동물모델에서의 NEDD4의 기능을 알아보기 위해, 조골세포에서 특이적으로 전사활성이 나타나는 2.3-kb 사이즈의 Collagen Type I Alpha 1 chain (Col1α1) 프로모터에 의해 조골세포에서만 NEDD4의 과발현이 나타나도록 하는 조건부 유전자 도입 마우스를 제작하였다. 또한, 동일한 프로모터 활성에 의해 조골세포에서만 특이적으로 NEDD4의 발현을 없애 버릴 수 있는 조건부 유전자 결손 마우스를 제작하였다. NEDD4가 과발현된 유전자 도입 마우스들은 대퇴골 조직에서 뼈 질량이 증가하였고, 조골세포 관련 마커들의 전령 RNA 발현이 증가되어 있었다. 게다가, NEDD4유전자 결손 마우스들은 뼈 질량이 감소하고 조골세포 관련 마커들의 전령 RNA 발현이 감소된 것을 확인하였다. 유전자 도입 마우스의 머리덮개뼈에서 분리된 조골세포의 성장 또한 정상 마우스보다 높았으며, 다리 경골내에 존재하는 조골세포 수와 표면적 역시 정상 마우스에 비해 높은 수치를 보였다. 중간엽 줄기세포로부터 조골세포로 분화하는 과정 동안 Nedd4와 Tgfb1의 전령 RNA는 동일한 패턴으로 분화 초기 때 높았다가 후기 때 낮아지는 양상을 보였으나, Bmp2는 그 반대의 패턴을 확인할 수 있었다. NEDD4는 TGFβ1 신호에 의해 일시적으로 인산화되는 pSmad1을 분해시켜 TGFβ1 신호를 더욱 강화시켜 주었고, pErk1/2 역시 유전자 도입 마우스 유래의 조골세포에서 더 증가된 것을 확인하였다. 위의 결과들에 의해, 뼈 형성 과정의 초기에 NEDD4가 TGFβ1 신호전달 시스템을 조절함으로써 조골세포의 성장을 촉진시켜 준다는 것을 규명하였다. 2장에서는 세포 죽음을 유도하는 산화 스트레스에 관련된 여러 종류의 E3 유비퀴틴 리가아제들이 알려져 있는데 그 중, NEDD4가 중간엽 줄기세포에서 외부적 산화 스트레스 조절에 어떻게 관여하는지를 규명하였다. 먼저, 매우 낮은 농도의 과산화수소를 인간 골수유래 중간엽 줄기세포에 처리했을 때, 세포의 성장이 증가된 반면, 치사량 이상의 고농도의 과산화수소를 처리하면, 세포사멸이 증가되었다. 크로마틴 면역침강법을 이용해 적정농도의 과산화수소를 처리했을 때, 전사인자인 NFκB가 NEDD4 프로모터 지역에 붙어 NEDD4발현의 증가를 유도하는 것을 확인하였다. 과산화수소에 의해 증가된 NEDD4는 LATS의 분해를 촉진하여 그 하위 인자인 YAP의 인산화가 감소하였고, YAP이 세포질에서 핵 내로 이동하는 것을 증가시켜 전사인자로서의 활성을 증가시켰다. 따라서, YAP의 타겟 유전자인 CATALASE와 MnSOD의 발현이 과산화수소 처리에 의해 증가하지만, NEDD4 유전자가 결손 된 세포에서는 과산화수소를 처리해도 감소하였다. 과산화수소에 의해 생긴 ROS를 제거하는 능력도 NEDD4 유전자 결손 된 세포에서는 감소하였다. 뿐만 아니라, NEDD4 유전자 결손에 의해 골수유래 중간엽 줄기세포의 조골세포로의 분화가 감소되었으나, YAP의 127번 Serine을 Alanine으로 치환 시킨 세포에서는 분화능이 정상적으로 회복되었다. 모든 결과들을 종합해 볼 때, 과산화수소에 의해 발현이 증가된 NEDD4는 Hippo 신호 전달 경로를 조절하여 세포의 산화 스트레스를 방지한다.

Neural precursor cell expressed developmentally downregulated protein 4 (NEDD4) is an E3 ubiquitin ligase which catalyze the binding of ubiquitins to target substrates. The role of NEDD4 has been well-known as a regulator of proliferation and development of several kinds of cancers via involving in many signal pathways. However, the specific function of NEDD4 in bone marrow-derived stem cells are covered yet. In this study, I determined the role of NEDD4 during osteoblast differentiation from BMSCs through regulation of TGFβ1/BMP2 signaling and the protective effect of NEDD4 against oxidative stress in BMSCs by repression of Hippo signaling pathway. The study in chapter I, the role of NEDD4 was revealed as a positive regulator of proliferation in immature osteoblast via enhancing TGFβ1 signaling pathway. To investigate the role of NEDD4 in skeletogenesis in vivo, I established immature osteoblast-specific 2.3-kb Collagen Type I Alpha 1 chain (Col1α1) promoter-driven Nedd4 transgenic (Nedd4-TG, Col1α1-Nedd4Tg/+) mice and conditional knockout (Nedd4-cKO, Col1α1-Cre;Nedd4fl/fl) mice. The Nedd4-TG mice displayed enhanced bone mass accrual and upregulated gene expression of osteogenic markers in bone. In addition, bone formation was decreased in the Nedd4-cKO mice compared to that in their littermates. The proliferation of primary osteoblasts isolated from calvaria and the number and surface area of tibial osteoblasts were higher in the Nedd4-TG mice than those in their littermates. Throughout the osteoblast differentiation, the expression of Nedd4 and Tgfb1 were high at early stage of osteoblast maturation, but decreased at the later stage when Bmp2 expression level is high. TGFβ1 signaling was consolidated by degradation of pSMAD1, which was transiently induced by TGFβ1, in NEDD4-overexpressing osteoblasts. Furthermore, pERK1/2 signaling was enhanced in osteoblast from TG mice than those in their littermates. These results suggest that NEDD4 enhances osteoblast proliferation by removing pSMAD1 activated by TGFβ1, and potentiating pSMAD2 and pERK1/2 pathways at early stage of bone formation. E3 ubiquitin ligases are also involved in the regulation of oxidative stress-induced cell death. CHAPTER II is a study of the mechanism how NEDD4 enhance proliferation and inhibit apoptosis by regulation of Hippo signaling in H2O2-treated hBMSCs. Cell proliferation was increased in low doses of H2O2 (10-4~10-2 μM), whereas sub-lethal concentrations of H2O2 (> 200 μM) induced apoptosis. A chromatin immunoprecipitation assay identified that recruitment of NFκB onto the promoter region of NEDD4 mediated H2O2-induced NEDD4 expression. The increase of NEDD4 expression by H2O2 induced translocation of Yes-associated protein (YAP) into the nucleus by decreasing the stability of large tumor suppressor kinase (LATS). Thus, the phosphorylation of Serine 127 residue of YAP by LATS upstream kinase is decreased and thereby increased the transcriptional activity of YAP. The mRNA expression levels of CATALASE and MnSOD, which are well-known targets of YAP, were increased by H2O2 treatment, but downregulated by NEDD4 silencing using a specific siRNA (siNEDD4). H2O2¬-induced ROS scavenging capacity was also decreased by siNEDD4 in hBMSCs. Finally, hBMSC differentiation into osteoblast was decreased by siNEDD4, but reverted by reintroduction of the YAP-S127A mutant. Taken together, these results indicate that NEDD4 regulates H2O2-induced alteration of cell status through regulation of the Hippo signaling pathway.