A Novel Antibody Screening Method for Detection of Rare Antibodies

Abstract

생명공학기술의 발전에 따라 바이오의약품의 성공률이 점차 증가하면서 제약회사들의 관심이 증가하고 있다. 특히 항체 의약품에 대한 관심이 증대되어 현재 제약시장을 선도하고 있으며, 향후 5~6년간 연성장률 12.8%를 보일 것으로 전망되고 있다. 따라서 항체 신약 개발의 중요도가 점차 올라가고 있다. 항체 신약 개발의 초기 장애물 중에 하나는 수백만 개의 후보군들 안에서 유의미한 몇 안되는 항체를 발굴하는 점이다. Phage display 기술은 신약 개발 과정에서 항체 라이브러리 분석을 위해 가장 널리 쓰이는 방법이다. 다양한 항체 정보를 포함하는 phagemid 라이브러리를 phage의 표면에 발현하여, 유전형-표현형의 연결고리를 제공하여 항체의 선별과 분석을 용이하게 한다. Biopanning이라 불리는 과정을 통하여 특정한 항원과 높은 결합력을 갖는 항체를 강화하여 가장 높은 결합력을 가진 결합체를 여러 번의 biopanning을 거쳐 수많은 후보군들 속에서 선별하게 된다. 거대 라이브러리 분석이 가능한 높은 처리 용량과 손쉬운 분석 과정, 낮은 비용을 통한 뛰어난 분석 역량은 phage display가 항체 신약 발굴에서 가장 강력한 도구가 되게 했다. 이러한 장점들에도 불구하고, phage display는 소요 시간 및 비용, 강도 높은 노동, 제한된 분석 크기와 결합체의 손실과 같은 단점들이 있다. 첫 번째로, 노동력을 많이 필요로 하는 colony picking과 각각의 phage에 대한 기능 분석은 분석 가능한 라이브러리의 크기를 고작 수백개로 축소 시킨다(전체 라이브러리의 크기>10^9). 이러한 분석 가능한 라이브러리의 제한 때문에 특정 항원과 결합하는 클론들을 증폭시키기 위하여 biopanning 과정을 여러 번 반복하게 된다. 멀티채널 피펫 장비, 96웰 플레이트와 같은 자동화 장비를 통해 노동을 줄이려는 노력이 있었지만, 다수의 biopanning을 줄이기에 충분한 처리량을 제공하지 못했다. 또한 각각의 biopanning 과정에서 결합체의 손실이 발생하게 된다. 충분하지 않은 결합체의 용리로 인하여 높은 결합력을 가진 결합체는 손실되고, 증폭 과정에서의 편중으로 인하여 희귀 결합체 또한 손실된다. 자성입자의 이용을 통한 표면적의 증가로 인해 항체-항원 결합과정에서의 효율성을 증가 시킬 수 있었지만, 다른 과정에서는 별다른 효과가 없었다. 따라서 전 과정에서의 높은 처리량의 확보를 통하여 다수의 panning을 줄여, 소요 시간 및 비용, 결합체의 손실을 최소화 해야 한다. 생명과학 분야의 발전에 기여한 마이크로기술을 적용하기 위한 많은 노력이 있어왔다. 특히 phage display 적용을 위하여, 다양한 단일 세포 수준 분석법이 편향된 증폭을 최소화하고 처리량을 최대화 하여 다수의 panning을 감소시키는 방향으로 개발되었다. 높은 집약도로 이루어진 미세모세관 칩을 이용한 미세모세관 기술의 도입을 통해, 백만 개 이상의 항체들을 한번에 성공적으로 분석하였다. 또한 미세유체 기술을 도입하여 미세에멀젼을 통해 이론적으로 거의 무한에 가깝게 처리량을 증가하였다. 두 기술 모두 극도로 높은 처리량을 통해 다수의 panning을 줄이는 것에는 성공하였지만, 복잡한 샘플 회수 방법이 요구된다. 게다가 두 기술 모두 샘플 회수의 과정에서 교차 오염이 일어날 가능성이 높은 단점이 있다. 본 논문에서는 미세우물 어레이 칩과 자동화된 레이저 샘플 분리 장비를 이용하여 높은 처리량을 가진 phage display 기술을 개발하였다. 단일 세포 접근법과 정교한 샘플 분리 방법을 함께 적용하여 샘플의 교차 오염뿐만 아니라 증폭 과정에서의 편중을 최소화하고, 높은 처리량의 샘플 회수를 가능하게 하였다. 면역원성 제거를 목적으로 한 합성 항체 라이브러리를 기존의 biopanning 방식으로는 발굴할 수 없었던 새로운 항체 발굴을 위하여 개발된 phage display 기술로 분석하였다.

The success rate of biologics, especially antibody drugs, is increasing due to the development of biotechnology, which is augmenting the interest of pharmaceutical companies. Antibody drugs are leading the pharmaceutical market, and are predicted to grow with a CAGR 12.8% over the next 5~6 years. One of the obstacles in the early stage of antibody-drug discovery is the selection of a few potential antibodies among the billions of candidates. Phage display is the most widely used technology for screening antibody libraries in therapeutic drug discovery. A variety of antibodies encoded in the form of phagemid library can be displayed on the surface of phage, providing genotype-to-phenotype linkage, making them a useful tool for antibody selection and identification. The biopanning process selectively enriches a set of antibodies having high affinity to a given antigen, so that the best binders can be taken amongst a number of potential candidates after experiencing multiple rounds of biopanning. The tremendous screening capability, along with several advantages such as the capacity to screen large libraries, easy manipulation, and low cost of propagation, has made phage display the most powerful tool for antibody drug discovery. Despite such advantages, phage display technology has technical limits, such as time-consuming, laborious work, the limited screen size, and loss of binders. First, the laborious colony picking and functional testing of individual phages clones limit the screen size to hundreds compared to the size of the whole library(>10^9). Due to this limited screen size, multiple rounds of biopanning are required for sufficient enrichment of positive clones, which take from two weeks to a month. Automated procedures were developed for reducing laborious work with a multichannel pipetting device and 96well plate, but these methods do not extend the screen size enough to eliminate multiple rounds of biopanning. There is also a loss of binders in each panning step. Insufficient elution causes the loss of high-affinity binders, and the amplification bias leads to the loss of rare binders. The use of magnetic beads that offers an increased surface area minimizes the loss in the binding step but does not have an impact on the other steps. The high-throughput method in the whole panning step is needed to reduce multiple rounds of biopanning for minimization of time-consuming, laborious work, and the loss of binders. There have been many efforts to adopt microtechnologies to make advances in the field of bioscience. For phage display applications, especially, various single-cell level analyses were developed to both minimize amplification bias and maximize the throughput of analysis, thereby reducing the number of panning rounds. By employing a microcapillary device having densely-packed microreaction chambers, more than one million antibody clones were successfully screened at once. A microfluidic device was also utilized to generate water-in-oil microemulsion reaction chambers, increasing the analysis throughput to infinite in theory. Although both methods could reduce the number of required panning rounds with extremely high throughput, complicated sample isolation approaches are needed to be accompanied. In addition, both methods are prone to possible sample cross-contamination at sample retrieval. In this dissertation, a high-throughput phage display technology using a microwell array chip and an automated laser-driven sample retrieval system has been developed. The use of the single-cell level approach in combination with an elaborate sample retrieval method enables high-throughput sample retrieval at minimal amplification bias as well as sample cross-contamination. Using the developed phage display platform, screening of synthetic deimmunization library is demonstrated, obtaining novel antibody clones that were not detectable in the conventional biopanning method.