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Structural and mechanistic analyses of the DNA repair nuclease SbcD from the foodborne pathogen Staphylococcus aureus
식품매개 병원균 황색포도상구균 유래 DNA 수선 핵산가수분해효소 SbcD의 구조 및 기작 분석

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Authors
이진욱
Advisor
하남출
Issue Date
2020
Publisher
서울대학교 대학원
Keywords
Staphylococcus aureusfoodborne pathogenDNA double-strand breakageDNA repairNucleasecrystal structure황색포도상구균식품 매개 병원균DNA 이중 가닥 파괴DNA 수선핵산가수분해효소결정구조
Description
학위논문 (석사) -- 서울대학교 대학원 : 농업생명과학대학 농생명공학부, 2020. 8. 하남출.
Abstract
Staphylococcus aureus is a major foodborne pathogen causing food poisoning in humans. To prevent infection of S. aureus, food must be sterilized by proper treatments during food processing, such as heating, ultraviolet light radiation, and hypochlorous acid (HOCl) treatment. These treatments give damages to the bacterial DNA, for instance, DNA double-strand break (DSB), thereby inhibition of protein expression, leading to the death of the bacteria. If bacteria have robust DNA repair systems, the bacteria could have a strong resistance to the treatments. In S. aureus, a SbcCD complex was known as an essential component of the DSB repair system. The SbcCD complex recognizes and cleaves the DNA ends in DSB by ATP-dependent endo- and exonuclease activities as the initial step of the DNA repair. The SbcD component consists of a nuclease, capping, and helix-loop-helix (HLH) domain. The structural studies of SbcD have focused on Gram-negative bacteria, and there is no structural information of SbcD in Gram-positive bacteria to date. Moreover, it remains to be elucidated the action mechanism at the molecular level of bacterial SbcCD complex. Here, I studied the nuclease and capping domain of SbcD from the Gram-positive bacteria S. aureus. The protein was overexpressed and purified, and its crystals suitable for the structural study were obtained. X-ray diffraction dataset was collected at a resolution of 2.9 Å, and the structure of the SbcD nuclease and capping domain (NCD) was determined by X-ray crystallography. Two manganese ions were found at the active site of SbcD and were coordinated by seven residues, sharing with SbcD of E. coli. The nuclease activity test with the SbcD-NCD protein exhibited the endonuclease activity on supercoiled DNA, and the exonuclease activity on linear DNA and nicked DNA. Combined with the structural and functional results, a molecular mechanism on how the SbcCD complex regulates these activities in repairing the DSB was proposed. Since SbcD is essential in the survival of S. aureus like other bacteria from DNA damage stresses, this study will provide a potential in controlling foodborne pathogen S. aureus by suppressing the resistance to food sterilization processes.
황색포도상구균은 대표적인 식품 매개 병원균으로 감염되면 식중독을 유발할 수 있다. 황색포도상구균의 감염을 예방하기 위해서는 식품에 가열, 자외선 조사, 차아염소산 처리와 같은 적절한 처리를 통해 살균해야 한다. 이런 살균 처리는 박테리아의 DNA에 손상을 입히는데 주로 DNA 이중 가닥 파괴를 유도하여 단백질의 발현을 억제하게 되고, 그 결과 박테리아가 사멸하게 된다. 하지만 박테리아는 이런 DNA 손상 스트레스에 저항하는 기작인 DNA 수선 기작을 갖고 있다. 황색포도상구균의 SbcCD 복합체는 DNA를 수선하기 위해 ATP-의존성 핵산 외부/중간 가수분해 활성에 의해 DNA 이중 가닥 파괴 부위에서 DNA 말단을 절단한다. 그 중 SbcD는 핵산가수분해 도메인, 캡핑 도메인 및 헬릭스-룹-헬릭스 도메인으로 구성되어 있다. SbcD의 구조 연구는 주로 그람 음성균에서 진행되었으며 그람 양성균에서는 아직 SbcCD 복합체의 구조가 규명되지 않았다. 또한, 박테리아 SbcCD 복합체의 작용 메커니즘을 분자 수준에서 설명할 수 있어야 한다. 본 연구에서는 그람 양성균인 황색포도상구균 유래의 SbcD 단백질을 과발현하고 정제하여 높은 순도의 고농도 단백질을 획득하여 구조 연구에 적합한 결정을 얻었다. X-선 회절 데이터는 2.9Å의 해상도로 수집되었고, SbcD 핵산가수분해 및 캡핑 도메인의 구조를 규명하였다. SbcD의 전체 구조를 보면 2 개의 망가니즈 이온이 SbcD의 활성 부위에서 발견되었고 7 개의 잔기에 결합되어 있었으며, 이는 대장균의 SdcD와 유사함을 보였다. SbcD-NCD 단백질에 의한 핵산가수분해 활성 실험은 슈퍼코일 DNA에 대한 핵산 중간 가수분해 활성과 선형 DNA 및 개방 된 원형 DNA에 대한 핵산 외부 가수분해 활성을 나타냈다. 구조 및 기작 결과를 바탕으로 SbcCD 복합체가 DNA 이중 가닥 파괴를 복구하는데 있어서 복합체의 활성을 어떻게 조절하는지에 대한 분자적 기작이 제시되었다. SbcD는 황색포도상구균뿐만 아니라 대부분의 박테리아에 보존되어 있는 DNA 수선 관련 단백질로 박테리아의 생존에 필수적이다. 식품 살균 과정에서 SbcD의 활성을 조절하는 것은 식품 살균에 대한 박테리아의 내성을 억제함으로써 식품 매개 병원균인 황색포도상구균을 제어할 수 있는 가능성을 제공할 것이다.
Language
eng
URI
https://hdl.handle.net/10371/169650

http://dcollection.snu.ac.kr/common/orgView/000000161572
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Appears in Collections:
College of Agriculture and Life Sciences (농업생명과학대학)Dept. of Agricultural Biotechnology (농생명공학부)Theses (Master's Degree_농생명공학부)
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