Physiological and genomic analysis of enhanced heat resistance in probiotics by Adaptive Laboratory Evolution

Abstract

Stress resistance is important in food manufacturing processes that use lactic acid bacteria (LAB). In particular, high temperature is a key factor that negatively affects bacterial growth and even leads to cell death. Development of heat-resistant strains continues, but developmental studies accompanying genomic analysis to identify the causal factors of the resistance mechanisms are still insufficient. Furthermore, it is necessary to develop strains with tolerance to multiple stresses. Thus, the development of heat-tolerant strains is a major issue in the bioprocesses. Adaptive Laboratory Evolution (ALE) could be applied as an efficient way to overcome such limitations. ALE is a method that utilizes the basic mechanisms of molecular evolution that accumulate in microbial populations under specific growth conditions. The ALE is being successfully utilized to improve the ability of microorganisms to withstand a variety of stressful environments such as acid, osmotic pressure, and temperature. In chapter 2, a method of heat adaptation was implemented in an attempt to increase the upper thermal threshold of two Streptococcus thermophilus found in South Korea and identified the alterations in membrane fatty acid composition to adaptive response to heat. In order to develop heat tolerant lactic acid bacteria, heat treatment was continuously applied to bacteria by increasing temperature from 60°C until the point that no surviving cell was detected. The results indicated significant increase in heat resistance of heat-adapted strains compared to the wild type (WT) strains. In addition, the strains with improved heat resistance acquired cross protection, which improved their survival ratio in acid, bile salts and osmotic conditions. A relation between heat resistance and membrane fatty acid composition was identified that the ratio of saturated fatty acids (SFA) was increased. These results support the hypothesis, that the consequent increase of SFA ratio is a cellular response to environmental stresses such as high temperatures, and it is able to protect the cells from acid, bile salts and osmotic conditions via cross protection. In chapter 3, a newly designed adaptive evolutionary method was applied to induce heat adaptation of Enterococcus faecium strain. One Enterococcus faecium strain named BIOPOP-3 was isolated and completed a full-length genome sequence. Using this strain as a WT, a two-step ALE method was applied to obtain a heat-resistant strain, BIOPOP-3 ALE. After sequencing the whole genome, two full-length sequences of WT and ALE strains were compared and identified five non-synonymous variants that could confer heat resistance, which were technically validated by resequencing. I experimentally verified that the evolved strain was significantly enhanced in not only heat resistance but also acid and bile resistance. I demonstrated that the developed heat-resistant strains can be applied in animal feed manufacturing processes. This study demonstrated that the multi-stress-resistant strains developed in this study and this ALE method are expected to be widely applied in industrial and academic fields. In addition, I expect that the identified variants which occurred specifically in heat-resistant strains will enhance molecular biological understanding and be broadly applied to the biological engineering field.

유산균을 사용하는 식품 제조 공정에서 스트레스 내성은 중요하다. 특히, 고온은 박테리아 성장에 부정적인 영향을 미치고 심지어 세포 사멸을 초래하는 핵심 요소이다. 내열성 균주의 개발은 계속되지만, 저항 메커니즘의 인과적 요인을 식별하기위한 게놈 분석을 동반한 개발 연구는 여전히 부족하다. 또한, 다중 스트레스에 대한 내성을 가진 균주를 개발 해야한다. 따라서, 내열성 균주의 개발은 바이오 프로세스에서 주요한 문제이다. ALE (Adaptive Laboratory Evolution)는 이러한 한계를 극복하기위한 효율적인 방법으로 적용될 수 있다. ALE는 특정 생장 조건 하에서 미생물 개체군에 축적되는 분자 진화의 기본 메커니즘을 이용하는 방법이다. ALE는 산, 삼투압 및 온도와 같은 다양한 스트레스 환경을 견딜 수 있는 미생물의 능력을 향상시키는 데 성공적으로 활용되고 있다. 2장에서는, 한국에서 발견된 2개의 스트렙토코커스 서모필러스 (Streptococcus thermophilus)의 내열성을 향상시키기 위해 열-적응 ALE 방법을 시행하였고, 막 지방산 조성 분석을 통해 열에 대한 적응 반응으로써 지방산 조성 변화를 확인 하였다. 내열성 유산균을 개발하기 위해 온도를 60℃부터 생존 세포가 검출되지 않을 때까지 증가시켜 박테리아에 연속적으로 열처리를 하였다. 결과는 야생형 (WT) 균주와 비교하여 열-적응 균주의 내열성의 유의한 증가를 나타냈다. 또한, 내열성이 개선된 균주는 교차 보호를 획득하여 산, 담즙염 및 삼투 조건에서 생존율을 향상시켰다. 내열성과 막 지방산 조성의 관계는 포화 지방산 (SFA)의 비율이 증가한 것을 확인 하였다. 이 결과는 결과적으로 SFA 비율의 증가가 고온과 같은 환경 스트레스에 대한 세포 반응이며, 교차 보호를 통해 산, 담염 및 삼투 상태로부터 세포를 보호 할 수 있다는 가설을 뒷받침하였다. 3 장에서는, 엔테로코쿠스 페시움(Enterococcus faecium)의 열 적응을 유도하기 위해 새롭게 설계된 적응적 진화 방법을 적용 하였다. BIOPOP-3라는 하나의 엔테로코쿠스 페시움 균주를 분리하여 전장 게놈 서열을 완성 하였다. 이 균주를 야생형(WT)으로서 사용하여, 2 단계 ALE 방법을 적용하여 내열성 균주 BIOPOP-3 ALE를 획득 하였다. 전체 게놈을 시퀀싱 한 후, 2 개의 전장 서열을 비교하여, 내열성을 부여 할 수 있는 5개의 동일하지 않은 변이체를 확인하였으며, 이는 시퀀싱에 의해 기술적으로 검증되었다. 본인은 실험적으로 진화된 균주가 내열성뿐만 아니라 산 및 담즙 내성에서도 유의하게 향상되었음을 검증했다. 본인은 개발된 내열성 균주를 동물 사료 제조 공정에 적용 할 수 있음을 증명했다. 이 연구는 실험을 통해 개발된 다중-스트레스 저항성 균주와 이 ALE 방법이 산업 및 학술 분야에 널리 적용될 것으로 예상한다. 또한, 내열성 균주에서 특이적으로 발생하는 확인된 유전적 변이체는 분자 생물학적 이해를 향상시키고 생물학적 공학 분야에 광범위하게 적용될 것으로 기대한다.