Prenatal exposure to bisphenol S and influence on obesity in F1 generation

Abstract

Bisphenol S (BPS) is increasingly used as a replacement for Bisphenol A (BPA), a known endocrine disruptor. It has been well documented that prenatal exposure to BPA affects not only fetal development but also metabolic diseases including obesity in adolescence and adulthood. While an increasing number of studies has explored whether the structurally similar BPS could likewise affect health outcomes, research on the link between fetal exposure to BPS and adiposity in later life is still underexplored. The overall goal of this study is to investigate the adiposity effects of prenatal exposure to BPS in adult mice. There are three knowledge gaps that need to be addressed for a better understanding of the effects of early life exposure to BPS on adiposity in later life: (1) whether maternally delivered BPS to the fetus/neonate would be totally transformed to its conjugates and easily excreted is limited; (2) unclear periods of BPS exposure that are linked with adiposity in adulthood; (3) limited evidence of in vivo studies on BPS-induced adiposity and epigenetic modification. To address these important knowledge gaps, this study consists of three key studies that make up the main chapters of this dissertation.

In the first study (Chapter 2), each of the BPS metabolites was determined at postnatal day 1 (PND1) to investigate whether maternally delivered BPS was totally excreted and transformed to inactive metabolites such as BPS-glucuronide (BPS-G) and BPS-sulfate (BPS-S). The key hypothesis in Chapter 2 was that maternally delivered BPS may not be totally excreted after birth. Maternal BPS transferred to fetus, and the type of abundant metabolites is different from adults one. The liver of fetus is not fully developed yet, and thus, it is suspected that it cannot produce BPS-glucuronide at high enough levels to be detected in neonatal livers. Detectable levels of BPS metabolites were available in the tissues in BPS 50 mg/kg/d group. Predominant metabolites of BPS were BPS-S in liver tissues at PND1, and BPS-G in the rest of body in BPS 50 mg/kg/d group. It was found that in a day after the end of perinatal exposure to BPS, the fetal body retained approximately 14.6% of maternally delivered BPS.

The second study (Chapter 3) aimed to investigate the adiposity effects of prenatal exposure to BPS in adult mice. Pregnant mice were exposed to BPS via the drinking water from gestation day 9 until delivery. Then, two groups of offspring (six weeks old) were either fed a standard diet (STD) or high fat diet (HFD) until sacrifice. HFD was fed for 4 weeks. To observe adiposity phenotypes in adult offspring, the body weight and gonadal fat pad mass were measured. To assess changes in adipogenic marker genes, mRNA expression of Pparg, Cebpα, Fabp4, Lpl and Adipoq was analyzed in gonadal white adipose tissues (gWAT) of all males exposed to BPS. Prenatally BPS-exposed male on a HFD gained body weight and gonadal fat pad mass more than naïve control on the same diet. There were significant increases of mRNA of all adipogenic markers in male BPS-exposed mice fed with HFD. Noticeably, Lpl was observed as the BPS-effect in STD-fed males. These findings indicated that prenatal exposure to BPS associated with the upregulation of mRNA expression of the key adipogenic marker genes resulting in the manifestation of adiposity phenotype. Furthermore, we suggest that the elevated Lpl mRNA level might be a potential susceptibility marker of BPS-induced adiposity in male offspring.

In the final study (Chapter 4), DNA methylation of adiposity-related imprinting gene in adipose tissue (especially gWAT) was evaluated to explain whether prenatal exposure to BPS affects fetal reprogramming. Igf2/H19 was selected as the adiposity-related imprinting gene. The effect of BPS exposure during fetal development on the imprinting gene was investigated with DNA methylation of Igf2/H19 ICR in gWAT. BPS-related CpG sites of Igf2/H19 ICR were observed in gWAT. These result suggested that BPS exposure during mid-gestation can alter the levels of DNA methylation in Igf2 and has an impact of specific CpG sites on it. Through a series of studies, it was clearly demonstrated that (1) maternally exposure to BPS transferred to fetuses and retained in neonate, (2) prenatal BPS was related to the susceptibility to adiposity in adulthood and (3) altered the levels of DNA methylation in adiposity-related imprinting gene, Igf2, in white adipose tissues, and (4) mid-gestation can be a sensitive window of fetal exposure to BPS. Our findings have important implications for the understanding of the vulnerable period of BPS exposure to the adult-onset obesity in epidemiology. On the context of DOHaD, additional research is needed on expression of adiposity-related imprinting gene resulting from such an exposure to BPS.

비스페놀 S (BPS)는 비스페놀 A (BPA)의 독성과 건강 유해성을 이유로 전세계적으로 사용이 금지되자 대체제로 등장하였다. 현재 BPS는 다양한 나라에서 실내 공기와 생체시료에서 검출되고 있다. 특히, 산모의 생체 시료 중 BPS 검출은 태반을 통한 태아의 노출 가능성까지 제기되어 생애초기 노출의 건강영향이 우려되고 있다. 내분비계장애물질 (Endocrine Disrupting Chemical; EDC)로 알려진 BPA는 태중 노출 시 태아 발달뿐만 아니라, 청소년기와 성인기의 비만을 비롯한 대사성 질환에 영향을 줄 수 있다고 보고된다. 전문가들은 BPA와 구조적으로 유사한 BPS도 BPA와 유사한 건강영향을 미칠 수 있다고 보고하고 있다. 최근 태아 발달시기를 포함한 생애초기 노출과 건강영향에 관한 연구가 증가하고 있으나, 여전히 산전 BPS 노출과 성체 지방 생성에 관한 연구는 부족하다. 생애초기 노출 연구가 중요한 이유는 태중 (in utero)과 영유아기는 체내 기관 형성 및 발달 시기로 그 기능이 미숙하여 노출물질의 대사와 체외 배출이 어려워질 수 있기 때문이다. 또한, 생애초기 환경이 이후 건강과 질병의 기원이 될 수 있음을 의미하는 DOHaD (Developmental Origins of Health and Disease) 가설을 기반으로 한 많은 연구들이 생애초기 다양한 EDCs 물질이 비만유발환경물질 (Obesogens)으로 작용하여 성인기 비만을 일으킬 수 있다고 보고하고 있다. 이러한 맥락에서 생애초기 환경과 출생 이후 건강영향을 잘 이해하기 위해서는 후성유전적 접근을 필요로 한다. 그러나 현재 BPS 산전노출에 따른 비만 영향 연구에 후성유전학적 연구는 제한적이며, 동물 실험을 통한 생애초기 노출과 후성유전적 변화에 관한 연구는 매우 부족하다. 본 연구의 최종 목표는 BPS 산전 노출로 인한 성체기 비만 감수성을 변화를 설명하는 것이다. 이를 위해, 임신마우스를 이용하여 BPS 노출 모델을 구축하였으며, 임신 9일차부터 임신 18일차 (출산 직전)까지 식수를 통한 BPS 경구 노출을 수행하였다. 먼저 모체를 통한 후속세대 F1의 BPS 노출 여부와 관련 대사체를 파악하고 (Chapter 2), BPS 산전노출에 의한 성체기의 비만 표현형 변화와 지방생성 관련 유전자의 발현량 변화 를 통해 드러난 비만 감수성의 변화를 설명하며 (Chapter 3), 마지막으로 각인유전자 Igf2의 DNA 메틸화 변화 여부를 살펴보았다 (Chapter 4).

첫 번째 연구 (Chapter 2)에서는 모체를 통한 BPS 노출이 태아에 전달될 수 있는지를 비롯하여 노출이 중단된 출생 이후 체외 배출이 용이한 대사체 (예. BPS-G, BPS-S)를 생성하는지 살펴보기 위해 수행되었다. 임신마우스를 통해 임신 9일차부터 출산직전까지 다양한 용량의 BPS (0, 0.05, 0.5, 5, 50 mg/kg/d )를 식수를 통해 지속적으로 노출시켰다. 후속세대 출생 직후 (PND 1)의 간(liver)과 간을 제외한 전신(whole body without liver)을 수집하여 UPLC-qTOF-MS로 BPS와 그 대사체를 측정하고 정량하였다. 분석 결과는 어미에게 노출시킨 BPS는 태아에게 전달되었음을 나타내었다. 검출수준 한계로 BPS 50 mg/kg/d 그룹의 생체시료에서만 정량 가능하였다. 성체의 주요 대사체로 알려진 BPS-G로 알려진 것과 달리, 본 연구에서는 PND1 (생후 1일차)에서 높은 검출률을 보이는 대사체는 BPS-S으로 나타났다. 또한 BPS 노출 중단 이후 1일 째 되었을 때 어미로부터 전달된 BPS의 14.6%가 체내 남아있었다. 이 연구의 결과는 성체기 대사 특성과 달리 출생직후에는 체외 배출이 쉬운 대사체로 알려진 BPS-G보다 상당량의 free-BPS가 존재하고 BPS-S의 형태로 대사되고 있음을 실험적으로 확인한 사례로써 중요한 의의를 지닌다.

두 번째 연구 (Chapter 3)에서는 BPS 산전 노출이 성체기 지방 생성에 영향을 줄 수 있는지 살펴보기 위한 목적으로 수행되었다. 모체를 통한 BPS 노출은 출생 이후에 이루어지지 않았으며, 성체기 (8-10주령)가 되었을 때 비만 표현형인 체중, 생식기 주변의 백색지방 (gWAT) 무게, 지방세포의 크기와 수를 관찰하여 BPS 노출 그룹간 비교하였다. 비만 감수성 변화를 뚜렷하게 관찰하기 위해 지방조직 발달이 끝나는 6주령부터 단기간(4주)의 고지방식이 (HFD)를 추가하였다. 또한 지방생성과 관련 유전자 (adipogenic marker genes) 변화를 살펴보기 위해 모든 노출 그룹의 gWAT에서 Pparg, Cebpα, Fabp4, Lpl, Adipoq의 mRNA 발현량을 비교하였다. 이 연구에서는 BPS에 산전 노출된 후 HFD가 수행된 수컷에서 체중 대비 gWAT 무게 비율의 증가를 확인하였으며, 본 연구의 모든 BPS 노출용량 그룹에서 gWAT 지방세포 수와 크기의 유의한 증가가 있었다. 그리고 BPS 5 mg/kg/d와 50 mg/kg/d 그룹에서 HFD 수컷의 지방생성 관련 유전자 mRNA 발현량의 유의미한 증가가 있었다. 특히 표준식이 (STD) 그룹의 Lpl mRNA 발현량 증가는 지방생성 표현형이 드러나지 않아도 지방생성 감수성 변화가 있음을 잘 보여준다. 본 연구를 통해 BPS 산전노출이 지방 생성 기전에 관여할 수 있음을 유전자 발현량 차이를 통해 실험적으로 증명하였다. 관찰된 지방생성 관련 유전자가 5개라는 점은 본 연구의 한계점으로 보일 수 있으나, BPS 산전노출 그룹 간 지방생성 유전자 발현량의 뚜렷한 차이는 BPS 노출 특이적 지방 생성 기전이 있음을 의미한다.

세 번째 연구 (Chapter 4)에서는 BPS 산전노출로 인한 후성유전학적 변화를 비만 관련 각인유전자 Igf2/H19 ICR의 DNA 메틸화를 통해 설명하고자 하였다. gWAT 으로부터 genomic DNA를 추출하고 Bisulfite 처리를 거처 Pyrosequencing을 수행함으로써 Igf2/H19 ICR에서의 DNA 메틸화 비율을 측정하였다. BPS 산전노출량에 따른 메틸화를 전체적으로 비교하고, 선정된 6개 CpG site 중 BPS에 영향을 받은 CpC site를 탐색하였다. 각 CpG sites 별 BPS 산전노출에 의한 DNA 메틸화 차이는 비모수 검정(Kruskal-Wallis)을 수행하여 나타냈다. 선정된 6개의 CpG sites 전체의 DNA 메틸화는 평균 50% 이하였으며, BPS 산전노출 그룹 간 DNA 메틸화의 통계적 차이를 보이지 않았다 (p>0.05). 한편, Igf2 CpG site 별로 DNA 메틸화를 살펴본 결과, BPS 산전노출 이후 STD 그룹에서는 CpG5와 CpG6에서의 DNA 메틸화 수준의 노출 그룹 간 유의미한 차이를 보였으며, BPS 산전노출 HFD 그룹의 CpG1과 CpG3에서 DNA 메틸화의 유의한 차이를 나타내었다. BPS 생애초기 노출 이후 STD를 유지할 경우 비만 표현형을 관찰할 수 없었지만, 특정 CpG sites에서 Igf2의 DNA 메틸화 변화를 보인 것으로 보아 BPS 산전 노출이 임신 중기부터 수행되어도 후성유전학적 변화에 영향을 미칠 수 있다는 것을 증명했다. 각인유전자 Igf2의 모든 CpG sites를 스크리닝하지 않았기 때문에 전체 메틸화 변화를 나타낼 수 없다는 한계점이 있음에도 불구하고, 본 연구는 BPA의 Igf2/H19 DMR 변화를 보인 선행연구와 달리, BPS 산전노출 시 Igf2/H19 ICR 의 DNA 메틸화 증가가 나타날 수 있음을 보여주기 때문에 BPS 특이적 후성유전적 기전이 있을 수 있음을 시사하고 있다. 또한 특정 BPS-responsive CpG site를 제시함으로써, 후속연구의 후성유전적 기전 이해에 도움을 줄 수 있는 연구로도 가치가 있다.

종합적으로 BPS 산전 노출로 인한 성체기 지방생성과 후성유전적 영향에 관한 세 연구를 통해, (1)어미를 통한 BPS 노출이 태아 및 신생 마우스에도 전달될 수 있음을 확인하였으며, (2) BPS 산전노출이 성체기 지방생성 감수성에 영향을 줄 수 있음을 증명하였으며, (3) gWAT에서 비만 관련 각인유전자 Igf2 의 DNA 메틸화 증가를 통해 임신중기의 BPS 노출이 후성유전적 변화에 영향을 줄 수 있음을 보여줌으로써 최종 연구 목표를 달성하였다. 보건학적으로 중요한 비만을 다양한 DOHaD 연구 사례와 같이 성인 생애초기 환경 노출로부터 접근할 수 있었다. 특히 본 연구의 특장점은 BPS의 중요한 노출 시기를 동물실험을 통해 증명했다는 점과 임신 중기에서 출산직전까지 짧은 기간의 BPS 노출만으로도 비만감수성에 영향을 줄 수 있음을 보여주었다는 것에 있다. 다만 비만 감수성 변화에 어떤 후성유전적 기전이 어떻게 관여하는지에 대한 생물학적 이해를 위해 후속 연구가 필요할 것으로 생각된다.