Bone Healing Effects of Osteogenic induced Mesenchymal Stromal Cell Sheets in Canine Fracture Models

Abstract

Nonunion and delayed union during fracture repair are critical in veterinary orthopedic surgery. Mesenchymal stromal cells (MSC) sheets have potential for clinical application in bone regeneration. The bone regeneration capacity of gelatin-induced osteogenic differentiated mesenchymal stromal cell sheets (GCS) was evaluated in this study. The effects were similar to those of osteogenic differentiated mesenchymal stromal cell sheets (OCS). The study comprised two parts. First, OCS and undifferentiated mesenchymal stromal cell sheets (UCS) were compared for bone regeneration. Second, the efficacy of frozen and thawed GCS (FT-GCS) on the osteogenic potential of fresh GCS was assessed. Both parts of the study evaluated the bone healing capacity in canine model. The first chapter compared the bone generation capacity of UCS and OCS in vitro and in vivo. Quantitative real-time polymerase chain reaction (rt-PCR) showed that runt-related transcription factor 2 (Runx2), bone morphogenetic protein 7 (BMP7) and hepatocyte growth factor (HGF) were upregulated in OCS compared to UCS. The expression levels of cyclooxygenase-2 (COX-2), interleukin-6 (IL-6), interleukin-10 (IL-10) and tumor necrosis factor - α (TNF-α) in UCS were markedly upregulated compared to OCS. In vivo, each stem cell sheet was applied in the radial fracture model. The proportions of external callus in the total bone volume of OCS group was significantly lower than that in the control. The OCS group showed significantly increased mature bone compared to the control and UCS groups. Fibrous connective tissue was increased in the UCS group. In OCS, the fracture sites could be stabilized by early bone healing and callus formation was reduced, suggesting that UCSs and OCSs had different tissue healing effects and OCS could be used for bone healing. The use of gelatin in the production of OCS increased bone differentiation-related factors, producing more solid OCS. In addition, the pathway of bone differentiation was different for OCS and GCS. Since it took several days to cultivate the OCS, the bone regeneration efficacy of the cell sheets was frozen and stored for easy evaluation of their clinical application. In the second chapter, the bone regeneration effects of fresh GCS (F-GCS) and FT-GCS were evaluated. The experiment was performed in two parts. The first part involved in vitro evaluation of osteogenic potential of F-GCS and FT-GCS. The second part involved in vivo examination of the bone healing effects of both sheets in a canine model of fracture. In vitro, rt-PCR revealed no significant difference in the values of osteogenic-related factors between the two groups, and in vivo results, the external callus and the connectivity of fracture sites in both the F-GCS and FT-GCS groups were significantly increased compared to the control group. The amount of mature bones at fracture sites was increased in the F-GCS and FT-GCS groups compared to the control group, with no difference between the F-GCS and FT-GCS groups. Thus, bone regeneration using fresh and frozen-thawed GCS was similarly effective. In conclusion, OCS can be clinically applied to promote early bone regeneration. In particular, OCS cultured with gelatin are more solid and osteogenic differentiated than OCS, even when frozen and stored, the bone regeneration effects of GCS could be expected.

골절 회복 과정에서의 불유합과 지연유합의 회복반응은 수의정형외과학에서 중요한 주제이다. 중간엽 유래의 줄기세포를 이용하여 제작한 세포시트가 골재생에 효과가 있다고 연구되어 있다. 또한 젤라틴을 이용하여 골분화 유도 줄기세포 시트 (GCS)를 제작하였을 때 골분화 유도 줄기세포 시트 (OCS)와 골재생능에 있어 큰 차이가 없음이 연구되었다. 두 파트로 구성된 본 연구의 첫 번째 실험에서 OCS 와 미분화세포시트 (UCS)의 골재생능에 대하여 비교하였다. 두 번째 실험에서는 젤라틴을 이용하여 배양한 골분화유도 줄기세포 시트의 신선한 상태와 동결시켰던 세포시트의 골재생 효과 차이를 확인하였다. 추가로 두 연구 모두 개 골절 모델에 적용하여 골 회복 반응을 평가하였다. 첫 번째 실험은 골절 회복에 있어서, 미분화 줄기세포 시트(UCS)와 OCS의 골 재생 효과를in vitro 와 in vivo 상에서 비교한 것이다. 정량적 중합효소 연쇄반응 실험을 통하여 OCS의 경우 UCS에 비하여 골형성단백질7 (BMP7), 형성전화증식인자 (TGF-β), Runx2, 그리고 HGF가 상승된 것을 확인할 수 있었다. 반면 UCS의 경우 OCS에 비하여 시클로옥시게나이제-2 (COX-2), 인터류킨-6 (IL-6), 인터류킨-10 (IL-10) 종양괴사인자-알파 (TNF-α), 가 상승되어 있는 것을 확인할 수 있었다. 요골 골절 모델에서 각 줄기세포시트를 적용하였을 때, OCS를 적용한 군에서 가골의 양이 유의적으로 적게 형성된 것을 확인할 수 있었다. 조직염색을 통하여 OCS 군에서 성숙한 골화세포들을 확인할 수 있었다. 반면 UCS를 적용한 군에서는 섬유조직들의 유의적인 상승을 확인할 수 있었다. 따라서 OCS의 경우 초기 골재생을 통하여 골절부의 안정성이 증가되었고, 그로 인해 가골의 형성이 줄어든 것으로 생각된다. 또한 UCS와 OCS의 경우 조직재생에 있어 다른 효과가 있는 것으로 보이며, OCS는 골 재생을 기대할 수 있다. OCS 제작 과정에 젤라틴을 이용하면 골분화 관련 인자들의 상승과 더 단단한 골분화 유도 줄기세포 시트를 제작할 수 있음이 연구되었다. 또한, OCS 와 GCS 의 경우 골분화 경로가 다름이 밝혀졌다. 첫 번째 실험 과정에서 골분화 줄기세포 시트를 배양하기 위하여 몇 일간의 시간이 소요되었기에, 이를 임상에 적용하기 용이한 방법으로 동결하여 보관했던 줄기세포 시트의 골재생 효능을 평가하였다. 두 번째 실험에서는 젤라틴을 이용하여 배양한 골분화 유도 줄기세포 시트 (F-GCS)와, 그것을 동결시켜 보관하였다가 녹인 골분화 유도 줄기세포 시트 (FT-GCS)의 골 재생 효과를 비교하였다. 실험은 크게 두 파트로, in vitro에서 F-GCS 와 FT-GCS 의 골분화 관련 평가, in vivo 에서는 요골 골절 모델의 비글견에게 적용하여 골재생 정도를 평가하였다. In vitro 실험,정량적 중합효소 연쇄 반응 결과 F-GCS 와 FT-GCS 에서 골분화 관련 인자들의 수치들도 유의미적인 차이가 없었다. In vivo 결과에서는 가골이 세포시트를 적용해준 군에서 증가된 것을 확인할 수 있었고, 골절부분의 연결성은 통제군에 비하여 세포시트를 적용해준 군에서 유의미적으로 상승되었다. 조직 염색상에서 골절부의 피질골 사이 부분에서 F-GCS 군과 FT-GCS 군에서 성숙한 뼈의 양이 통제군에 비하여 유의미적으로 상승되어 있는 것을 확인할 수 있었고, 두 군의 차이는 없었다. 따라서 젤라틴을 이용하여 배양한 골분화유도 줄기세포 시트의 경우, 신선한 상태에서 바로 사용하는 것과 동결 후 냉동 과정을 거쳐서 사용하여도 골재생에 비슷한 정도의 효과를 보인다. 결론적으로 골분화 유도 줄기세포시트의 경우, 빠른 골재생을 기대할 때 임상적으로 적용이 가능하다. 특히 젤라틴을 이용하여 배양한 골분화 유도 줄기세포 시트의 경우에는 골분화 유도 줄기세포시트에 비하여 단단하고 골분화가 더 많이 진행되며, 동결하여 보관하다가 사용하더라도 골분화 유도 줄기세포 시트의 골재생 효과를 기대할 수 있다.