Immunomodulatory Effect of Extracellular Vesicles Secreted by Canine Adipose Tissue Derived Mesenchymal Stem/Stromal Cell in Mouse Models of Inflammatory Bowel Disease

Abstract

The inflammatory bowel diseases (IBD) are characterized by relapsing inflammation and immune activation diseases of the gastrointestinal tract. Extracellular vesicles, which elicit similar biological activity to the stem cell themselves, have been used experimentally to treat dextran sulfate sodium (DSS)-induced colitis in murine models though immunosuppressive potential. However, the underlying mechanisms have not been fully elucidated. Tumor necrosis factor (TNF)-α stimulated gene/ protein 6 (TSG-6) secreted from stem cells is a major factor responsible for regulation of inflammatory responses. However, studies on TSG-6 in EVs have not yet been conducted, and, thus, further studies are required. This study aimed to assess therapeutic effects of canine adipose tissue derived mesenchymal stem/stromal cell (cASC)-produced EV in IBD mice models and explore the mechanism underlying the immunomodulatory properties. In first, the role of extracellular vesicles secreted from cASCs was investigated. GW4869, an exosome production inhibitor, was pretreated on stem cells to confirm the role of extracellular vesicles. In the case of stem cells treated with GW4869, it was confirmed that the immunomodulatory ability decreased significantly. Concanavalin A treated canine lymphocytes showed significantly increased level of pro-inflammatory cytokines, such as tumor necrosis factor α (TNF-α), interferon-γ (IFN-γ), interleukin-1β (IL-1 β) and interleukin-6 (IL-6) compared to the naïve group (TNF-α, 27.7 fold, p<0.001; IFN-γ, 125 fold, p<0.001; IL-1 β, 13.9 fold, p<0.001; IL-6, 7.9 fold, p<0.001). Pretreatment with GW4869 significantly reduced the immunosuppressive effects of cASCs (TNF-α, p<0.05; IFN- γ, p<0.05; IL-1β, p<0.005; IL-6, p<0.05). In addition, as a result of co-culturing the extracellular vesicle obtained through repeated ultra-high-speed centrifugation with immune cells, it was confirmed that it has an immunomodulatory effect such as stem cells. In second, I designed to demonstrate whether EV obtained by stimulating inflammatory cytokine on cASC improved anti-inflammatory and/or immunosuppressive potential of EVs, and/or their ability to alleviate inflammation in colitis. I also explored the correlation between immune cells and the inflammatory repressive effect of primed EVs. Pro-inflammatory cytokines such as TNF-α and IFN-γ increased immunosuppressive protein such as HGF, TSG-6, PGE2 and TGF-β in EVs (HGF, p<0.01; TSG-6, p<0.01; PGE2, p<0.05; TGF-β, p<0.001). DSS-induced colitis mice (C57BL/6, male, Control=4, DSS=6, DSS with EVs=6, DSS with primed primed EVs)were intraperitoneally administered EVs (100 ug/mice) on day 1, 3, and 5; colon tissues were collected on day 10 for histopathological RT-qPCR, western blot and immunofluorescence analysis. It was confirmed that the protein expression of pro-inflammatory cytokine in the inflamed colon was significantly reduced in the group of mice injected with primed EV than in the mice injected with naive EV (IL-6, 0.5 fold, p<0.001; TNF-α, 0.38 fold, p<0.001; IL-17, 0.33 fold, p<0.001). Importantly, EVs obtained from primed stem cells effectively induced macrophage polarization toward an anti-inflammatory M2 phenotype and enhanced regulatory T cells (Tregs) in colon using IF analysis (M2, 1.6 fold, p<0.001; Treg, 1.9 fold, p<0.05). In third part, I hypothesize that the tumor necrosis factor-α-stimulated gene/protein 6 (TSG-6) in EVs is a key factor influencing the alleviation of colitis symptoms. DSS-induced colitis mice (C57BL/6, male, Naïve=6, Sham=8, PBS=8, EV=8, CTL-EV=8, TSG-6 depleted EV=8) were intraperitoneally administered EVs (100 ug/mice) on day 1, 3, and 5. Colon tissue were collected on day 10 for histopathological, RT-qPCR and IF analysis. In mice injected with EVs, mRNA expressions of pro inflammatory cytokine in inflamed colon were decreased significantly ((TNF-α, 0.04 fold, p<0.0001; IFN-γ, 0.36 fold, p<0.01; IL-1β, 0.3 fold, p<0.05; IL-6, 0.29 fold, p<0.01; iNOS, 0.42 fold, p<0.001). However, when injected with TSG-6 depleted EVs, It was confirmed that mRNA expressions of pro inflammatory cytokine in the colon, which decreased when EV was injected, were significantly increased (TNF-α, 9.21 fold, p<0.05; IFN-γ, 2.26 fold, p<0.05; IL-1β, 2.45 fold, p=ns; IL-6, 1.86 fold, p<0.05; iNOS, 1.93 fold, p<0.05). In addition, it was confirmed that TSG-6 depletion EV administered intraperitoneally decreased the ability to induce the M2 phenotype in the inflammatory colon and enhance Tregs compared to naive EV (M2, 0.35 fold, p<0.001; Treg , 0.54 fold, p<0.01). In conclusion, I demonstrated here that TSG-6 in EV from cASCs can alleviated IBD in mice. In addition, EV obtained from ASC stimulated with TNF-α and IFN-γ confirmed that the immunomodulatory factors (such as TSG-6, PGE2, HGF and TGF-β) were increased and were effective in alleviating inflammation of colitis by increasing the polarization of macrophage from M1 to M2 and increasing the Tregs. These findings might provide a new and effective therapy for the EVs obtained from cASC against not only IBD, but also immune-mediated disease.

염증성 장질환이란 장 내부에 비정상적인 염증이 반복되는 만성질환으로, 흔히 궤양성 대장염과 크론병이 대표적이며, 면역반응 조절이상이 중요한 병인일 것으로 보고 있다. 일반적을 흔히 사용되는 약물은 5-aminosylicala 제제, 스테로이드 제제, azathioprine이나 6-mercaptopurine과 같은 면역억제제들을 사용하여, 장관의 염증반응을 비 특이적으로 억제하는데 초점이 맞춰져 왔다. 그러나 최근 활발히 진행되고 있는 기초 연구를 토대로 장관 염증에 관여하는 면역세포의 기능과 매개물질에 대한 새로운 이해가 가능하여 졌고 이를 기초로 하여 질환의 자연경과를 변화시킬 수 있는 특이한 발병기전을 겨냥한 새로운 생물학적 치료가 개발되고 있다. TNF-α와 interleukin (IL)-1β, IL-6, IL-9, IL-12은 염증을 유발하는 pro-inflammatory cytokine으로 밝혀졌고, IL-4, IL-10, IL-11, IL-13은 염증을 경감시키는 항염증 cytokine으로 알려져 있다. 실제로 염증성 장 질환에서는 이러한 두 군의 cytokine의 불균형이 관찰되고 proinflammatory cytokine의 조직 농도가 활동기에 증가되어 있으며, 이러한 경향성은 염증의 정도와 연관이 있다는 보고가 있다. 따라서 염증이 있는 조직에서 염증 인자의 조절을 통해 염증을 완화시키는 역할을 하는 중간엽 줄기세포는 사람과 동물에서 염증성 장질환의 치료 대안 중 하나로 촉망받고 있다. 세포밖 소포체는 세포간의 물질(단백질, 지질, 유전물질) 교환을 가능하게 하며, 생리적, 병리적으로 신호를 전달하는 매개체로서 기능한다. 이들은 모세포에서 유래한 물질을 목적 세포에 전달 및 자극을 줄 수 있기 때문에, 모세포의 종류에 따라 면역조절, 세포 운명변화, 암 생성 촉진 및 억제, 조직 재생 등 다양한 기능을 가지고 있다. 최근에는 줄기세포 유래 세포 밖 소포체가 면역세포 조절능력이 있을 뿐만 아니라, 면역매개 염증질환에 치료효과가 있음이 보고되고 있다. 그러나 개의 중간엽 줄기세포가 분비하는 세포밖 소포체가 염증성 장질환에서 어떠한 기전으로 증상을 완화시키는지는 자세히 알려져 있지 않다. 따라서 이번연구의 목표는 개의 지방조직으로부터 유래된 중간엽 줄기세포를 배양한 배지로부터 추출한 세포 밖 소포체를 염증성 장 질환 마우스 모델에서 치료제로 적용하여 치료효과를 평가하고, 그 기전에 대해서 연구하였다. 첫번째, 본인은 개 지방조직로부터 중간엽 줄기세포를 분리하였으며, 엑소좀 생성억제제인 GW4869를 줄기세포에 10μM농도로 전 처리하였다. 이러한 줄기세포를 키운 배지로부터 생성된 세포 밖 소포체를 측정한 결과, GW 4869 전처리 군에서 세포밖 소포체의 생성되는 양이 50% 미만으로 감소된 것을 확인하였다(p=0.0289). Trans-well system을 이용하여, Concanavalin A로 활성화된 개 말초혈액 유래 림프구와 줄기세포를 48시간동안 공 배양하였으며, mRNA 수준으로 전 염증 cytokine의 발현양을 확인하였다. 그 결과 GW 4869로 전처리한 줄기세포의 경우 처리하지 않은 그룹보다 활성화된 전염증 사이토카인을 억압하는 능력이 유의적으로 감소된 것을 확인할 수 있었다(TNF-α, p<0.05; IFN- γ, p<0.05; IL-1β, p<0.005; IL-6, p<0.05). 줄기세포를 배양한 배지로부터 반복적인 초고속 원심분리를 이용하여 세포밖 소포체를 분리하여, Concanavalin A로 활성화된 개 말초혈액 유래 림프구와 LPS로 전 처리된 개 대식세포(Macrophage) 세포주와 같이 공 배양하였으며. 면역세포에서 전염증 사이토카인의 유전적 발현수준을 확인해 본 결과, 줄기세포와 비슷한 수준으로 활성화된 면역을 억제하는 능력이 있는 것을 확인할 수 있었다. 두번째, dextran sulfate sodium(DSS)에 의해 대장염이 유발된 생쥐에서 개 줄기세포 유래 세포 밖 소포체의 치료효과와 그 기전에 대하여 연구하였다. TNF-α와 IFN-γ로 자극한 개 줄기세포 유래 세포 밖 소포체가 염증성 장 질환 모델에서 치료효과를 증대시킬 수 있는지 연구하였다. TNF-α와 IFN-γ로 줄기세포를 전처리 한 이후에, 전처리된 줄기세포를 배양한 배지에서 반복적인 초고속 원심분리를 통하여 세포 밖 소포체를 분리하였으며, 웨스턴블랏과 ELISA를 통하여 세포밖 소포체의 HGF, TSG-6, PGE2 및 TGF-β의 포함된 양을 확인한 결과, TNF-α와 IFN-γ로 전처리한 줄기세포에서 획득한 세포 밖 소포체의 경우, 이러한 면역조절인자들의 단백질 발현이 유의적으로 증가된 것을 확인하였다(HGF, p<0.01; TSG-6, p<0.01; PGE2, p<0.05; TGF-β, p<0.001). 대장염 마우스 모델에서 염증의 경감효과를 확인하기 위하여 DSS로 유발한 대장염 모델 마우스(C57BL/6, male, Control=4, DSS=6, DSS with EVs=6, DSS with primed primed EVs=6)에 1, 3, 및 5일차에 세포 밖 소포체(100μg/1회/마우스)를 복강내 투여하였다. TNF-α와 IFN-γ로 전처리한 줄기세포에서 획득한 세포 밖 소포체의 경우 전처리하지 않은 줄기세포에서 획득한 세포체를 주입할 경우보다 마우스의 염증성 결장에서 대식세포의 항 염증성 M2 표현형으로 분극을 효과적으로 유도하고, 조절 T 세포의 촉진을 통해 결장의 염증을 경감시키는 것을 확인할 수 있었다(M2, p<0.001; Treg, p<0.05; 대장조직 염증지표, p<0.05). 세번째, 세포밖소포체의 tumor necrosis factor-α-stimulated gene/protein 6 (TSG-6)가 대장염증상에 완화에 영향을 미치는 주요 요인임을 확인하였다. DSS에 의해 대장염이 유발된 생쥐(C57BL/6, male, Naïve=6, Sham=8, PBS=8, EV=8, CTL-EV=8, TSG-6 depleted EV=8)에 1, 3, 및 5일차에 세포 밖 소포체(100μg/1회/마우스)를 복강투여한 결과 세포밖 소포체를 주입받지 않은 대장염 마우스 모델과 비교하여 전 염증사이카인의 mRNA발현이 감소된 것을 확인하였다(TNF-α, 0.04배, p<0.0001; IFN-γ, 0.36배, p<0.01; IL-1β, 0.3배, p<0.05; IL-6, 0.29배, p<0.01; iNOS, 0.42배, p<0.001). 그러나 TSG-6가 결핍된 세포 밖 소포체를 투여한 결과 일반 세포밖소포체를 주입한 마우스보다 결장내 전염증 사이토카인의 유전적인 발현 수준이 증가된 것을 확인하였다(TNF-α, 9.21배, p<0.05; IFN-γ, 2.26배, p<0.05; IL-1β, 2.45배, p=ns; IL-6, 1.86배, p<0.05; iNOS, 1.93배, p<0.05). 또한, 복강 내 투여된 TSG-6 결핍된 세포밖소포체의 경우 일반 세포밖 소포체와 비교하여 염증성 결장에서 M2 표현형을 유도하는 능력을 감소시키고 Treg의 발현도 감소시키는 것으로 확인되었다(M2, 0.35배, p<0.001; Treg, 0.54배, p<0.01). 결론적으로, 이러한 연구들을 통해, 개의 지방유래 중간엽 줄기세포에서 분비하는 세포 밖 소포체가 염증성 장 질환을 완화시키는데 TSG-6가 주요한 역할을 하는 것을 증명하였다(P<0.01). 또한 TNF-α와 IFN-γ를 전처리한 개 줄기세포로부터 유래한 세포 밖 소포체는 염증조절 인자인 TSG-6, PGE2, HGF, TGF-β를 더 많이 분비함으로써 염증이 있는 조직에서의 M2 대식세포와 조절 T 세포의 증가와 증상의 개선이 더 있음을 확인하였다. 이러한 결과는 IBD에 이환 된 개에서 세포 밖 소포체를 치료제로 적용함에 있어서 주요한 근거이다.