Peptidyl-prolyl cis-trans isomerase NIMA-interacting 1 (Pin1) directly binds and stabilizes Nrf2 in breast cancer

Abstract

Peptidyl-prolyl cis-trans isomerase NIMA-interacting 1 (Pin1) specifically recognizes phosphorylated serine or threonine of a target protein and isomerizes the adjacent proline residue. Overexpression of Pin1 has been found in many types of malignancies, suggesting its oncogenic function. Recent studies have revealed constitutive activation of Nrf2, a transcription factor that regulates cellular redox homeostasis, in some transformed or cancerous cells, conferring an advantage for their growth and survival. Silencing of Pin1 by using siRNA or pharmacologic inhibition blocked the accumulation of Nrf2, thereby suppressing proliferation and clonogenicity of MDA-MB-231 human breast cancer cells and xenograft tumor growth in nude mice. Since Nrf2 harbours pSer/Thr-Pro motifs, I investigated whether Pin1 could directly interact with Nrf2 in the context of its implications in breast cancer development and progression. I found that Pin1 binds to Nrf2 which stabilizes this transcription factor by hampering proteasomal degradation. Notably, the interaction between Pin1 and Nrf2 was dependent on the phosphorylation of Nrf2 at Ser 215, 408 and 577. In another study, Keap1, the main inhibitor of Nrf2, was found to be phosphorylated at Ser 104 and Thr 277. These amino acids are preceded by proline and hence can be the putative binding sites for Pin1. I found the direct interaction between Keap1 and Pin1, and this was abolished upon substation of Ser 104 and Thr 277 with Alanine. The interaction of Nrf2 with Keap1 was markedly increased when Pin1 was downregulated. On the other hand, Keap1 knockout embryonic fibroblasts exhibited the enhanced interaction between Nrf2 and Pin1. Therefore, it is likely that Pin1 and Nrf2 may compete with each other for Keap1 binding. In conclusion, Pin1 plays a role in stabilization and constitutive activation of Nrf2 interfering the interaction between Nrf2 and Keap1.

단백질의 인산화는 세포내 신호전달 단백질들의 활성에 영향을 미치며, 세포내 기능 조절을 위해 매우 중요한 역할을 담당한다. 인산화 부위 중 세린/트레오닌 다음에 특이적으로 프롤린 (pSer/Thr-Pro)이 위치할 경우 CDKs, MAPKs, and GSK-3β등과 같은 proline directed kinase들 (에 의해 인산화된다. 프롤린은 cis나 trans의 conformation을 모두 채택할 수 있어 단백질의 접힘이나 기능 활성을 조절한다. Pin1 (peptidyl-prolyl isomerase family of proteins)은 프롤린 잔기의 cis/trans의 이성화반응을 촉매하는 효소로서 인산화된 세린/트레오닌 다음에 프롤린이 오는 motif에 유일하게 결합하여 cis/trans 이성질화를 촉진한다. Pin1의 구조는 N-말단에 있는 WW 도메인과 C-말단에 있는 PPIase 도메인으로 이루어져 있으며, WW 도메인은 기질 단백질과 결합하고 PPIase 도메인은 인산화된 세린/트레오닌-프롤린 (pSer/Thr-Pro) 모티프의 프롤린 이성질화를 통한 구조 변화에 관여한다. Pin1에 의한 기질 단백질의 구조 변화는 단백질의 활성, 단백질 상호결합 및 세포내 분포와 안정성에 영향을 미친다. Pin1은 세포 주기 발달에서 중요한 역할을 하는 단백질들을 조절하는 것으로 알려져 세포내의 Pin1 단백질 발현 수준의 변화는 세포의 과도한 증식과 관련된 질병인 암의 발생 및 진행에 영향을 줄 수 있다 Nrf2는 산화적 스트레스에 의해 유발되는 염증, 암 발생, 심혈관계 질환, 및 당뇨등의 병리학적 과정에 관여하여 세포를 보호해 준다. 정상적인 상태에서 Nrf2는 저해단백질인 kelch-like ECH-associated protein 1 (Keap1)에 결합된 비활성 상태로 세포질내에 존재한다. 하지만 세포가 활성산소종 또는 친전자성 물질에 의해 자극되면 Nrf2의 인산화 또는 Keap1이 thiol modification을 통해 Keap1으로부터 Nrf2가 분리된다. 이후 Nrf2는 핵내로 이동하고, 핵내에 존재하는 small Maf 단백질과 복합체를 이룬후 항산화 효소의 프로모터 지역에 결합함으로써 phase II 항산화/해독화 효소의 발현을 조절한다. 그러나 스트레스에 반응하여 일시적으로 활성화되는 정상세포의 경우와 달리 악성 종양 세포에서 Nrf2의 과도한 지속적인 발현은 암세포의 성장을 촉진시키고 항암치료의 효과를 감소시킨다. Nrf2 단백질에도 다수의 Pin1 결합부위 (pSer/Thr-Pro motifs)가 존재하므로, Pin1과 Nrf2과의 상호작용과 이를 통한 유방암 증식 및 진행에 미치는 영향에 관하여 연구하였다. 특히, Nrf2 단백질의 세린 215, 408 and 577의 인산화 잔기가 Pin1 과의 결합 부위임을 확인하였고, Pin1과 Nrf2의 결합은 Nrf2의 프로테아좀에 의한 분해를 억제함으로써 Nrf2의 안정화에 관여함을 알 수 있었다. 한편, Nrf2의 주요 억제 단백질인 Keap1은 유방암 세포내에서 세린 104번 잔기와 트레오닌 277번 잔기에서의 인산화가 이루어짐을 ESI-LC-MS 분석을 통하여 확인하였고, 세린 104번 잔기와 트레오닌 277번 잔기의 인산화가 차단된 돌연변이 세포는 Pin1과의 직접적 결합이 Keap1 wild type 세포에 비해 현저히 감소함을 확인 할 수 있었다. 또한 Pin1 siRNA를 처리한 MDA-MB-231 세포에서는 control siRNA 그룹에 비해 Nrf2와 Keap1의 결합이 증가하였으며, Keap1 knockout 마우스 배아에서 분리한 섬유아세포(embryonic fibroblasts)에서는 Nrf2와 Pin1의 결합이 증가되었다. 이를 통하여 Pin1과 Nrf2는 Keap1과의 결합에 있어서 서로 경쟁적 역할을 함을 확인하였다. 그러므로 Pin1은 Nrf2와 Keap1사이의 결합을 방해하며 Nrf2 단백질의 활성화와 안정화에 관여할 것으로 사료된다.