Effects of low-dose bisphenol A on transcriptional expression of breast cancer cell lines, tumor immunity, and cancer progression

Abstract

Introduction: Bisphenol A (BPA) used in the manufacture of polycarbonate plastics and epoxy resin has structurally estrogen-like activity and recent studies have indicated that exposure to BPA in environment and daily life may account for the increased incidence of breast cancer in the industrialized world. Multiple in vivo and in vitro studies have reported that BPA exposure at low doses can result in breast neoplastic lesions. However, the correlation among BPA exposure, transcriptional alterations in breast cancer cells and breast cancer progression is not fully elucidated. In this study, we investigated whether chronic exposure to low-dose BPA affects transcriptome expression alterations and malignancy in different subtypes of breast cancer cells and mouse xenograft models. Methods: This study consists of two independent experiments. 1. ER-positive MCF-7, HER2-enriched SK-BR3, triple-negative MDA-MB-231 cells were used as breast cancer cell lines according to hormone receptor status. We analyzed the RNA-sequencing data from breast cancer cells treated with BPA at a low dose (10−8 M) for 30 days. Sequencing libraries were constructed using a QuantSeq 3mRNA-Seq Library Prep Kits. Differentially expressed genes (DEGs) were determined using BEDtools following mapping libraries using Bowtie2 software. Functional analysis was conducted by online public database DAVID, KEGG and PANTHER etc. Moreover, a functionally organized network of DEGs belonging to among MCF-7/BPA, SK-BR3/BPA and MDA-MB-231/BPA cells was created using the Cytoscape software platform. Afterward, we analyzed the correlation between BPA-exposed DEGs and survival rate of patients with various subtypes of breast cancer using public database BreastMark. 2. We investigated the effects of BPA (10−8 M) on the regulation of MCF10DCIS.com cells, ductal carcinoma in situ (DCIS), considered early-stage breast cancer and of RAW264.7, macrophages, the most abundant population in tumor immune microenvironment to determine the DCIS progression to invasive metastasis. The effects of BPA exposure on MCF10DCIS.com cell proliferation and migration abilities were evaluated by MTT and Trans-well migration assays with 0.8 µm pore size. In addition, intracellular signaling pathways related to these abilities were analyzed by Western blotting. Immune function analysis of BPA-exposed macrophages was performed using real-time RT-PCR and western blot. Moreover, we evaluated interactions between breast cancer cells and macrophages through co-culture method with conditioned medium for 72 h or with trans-well chambers with 0.4 µm pore size. Tumor xenograft models for early-stage breast cancer were established by injection with DCIS.com/Luc-GFP cells into the second fat pad of mice after exposure to BPA (10−8 M) for 30 days via drinking water of immune deficient mice (BALB/c nude mice) at 3 weeks of age. We monitored tumor progression and metastasis with bioluminescence imaging. Afterward, we evaluated metastasis and immune function of tumor-associated macrophages by immunohistochemistry with macrophage marker F4/80, inflammatory M1 marker NOS2, protumorigenic M2 marker CD206 in lymph node tissues surrounding tumors as well as primary tumors, and CK5 for identifying metastatic breast cancer cells in lymph node tissues surrounding tumors. Result: 1. We confirmed common changes in immune functions such as NKT, NK and T cell activation and dendritic cell migration by transcriptome expression analysis across MCF-7, SK-BR3, MDA-MB-231 cells affected by chronic exposure to low-dose BPA. The high expression of immune-related genes (IL19, CA9, and SPARC) under BPA exposure was associated with decreased overall survival in patients with breast cancer. 2. In the same manner, results of the transcriptional analysis of MCF10DCIS.com cells exposed to BPA showed immune-related alterations. BPA exposure promoted proliferative and migratory abilities of MCF10DCIS.com cells and induced polarization of RAW264.7 cells toward the M1/M2 phenotypes with high expression of NOS2, arginase-1, and CD206. Chronic low-dose BPA exposure group showed induction of M2 phenotype tumor-associated macrophages surrounding primary tumor, and were promoted tumor growth and lymph node metastasis in mouse model for breast cancer, as well. Conclusions: 1. These findings indicate chronic low-dose BPA exposure has dissimilar impacts on the regulation of gene expression and diverse biological functions, including immune modulation, in different subtypes of breast cancer cell. 2. These results demonstrate that BPA acts as an accelerator to promote DCIS progression to invasive breast cancer by affecting DCIS cell proliferation and migration as well as macrophage polarization toward a protumorigenic phenotype.

서론: 비스페놀A는 폴리카보네이트 플라스틱과 에폭시레진의 기본 원료로 사용되며 일부 감열지 현상제, 플라스틱, 치아밀봉재 등에도 사용되는 유기화합물이다. 구조적으로 여성호르몬인 에스트로겐과 유사하게 작용하여 유방암 발생률을 증가시키는 요인으로 제기되어 왔으나 비스페놀A 노출의 유방암 세포내 전사체 발현에 미치는 영향과 유방암 진행과의 상관관계에 대한 연구는 부족하다. 본 연구의 목적은 다양한 유방암 세포주와 동물모델에서 저용량 비스페놀A의 장기간 노출이 유방암 전사체 발현 변화와 유방암 악성도 촉발에 미치는 영향을 평가하는 것이다. 실험방법: 본 연구는 2개의 독립적인 실험 내용으로 구성되어 있다. 1. 유방암 세포주는 호르몬 수용체 유무에 따라 ER양성 유형인 MCF-7, HER2 과발현 유형인 SK-BR3, 삼중음성 유형인 MDA-MB-231을 사용하였다. 저용량의 장기간 비스페놀A 노출에 관한 전사체 분석은 30일간 10-8 M에 노출시킨 각 유방암 세포주들의 RNA를 분리한 후 RNA 염기서열분석을 진행하였고, QuantSeq 3 mRNA-Seq Library Prep Kit를 이용하여 염기서열 라이브러리를 만들었다. 이 라이브러리에서 Bowtie2 소프트웨어를 이용하여 매핑한 후 Bedtool프로그램을 통해 상이 발현 유전자들을 구분하였고 온라인 공개 데이터베이스인 DAVID와 KEGG, PANTHER 등을 통해 기능적 분석을 진행하였다. 또한 세포주들의 상이 발현 유전자 세트간 상호작용에 대한 매핑은 Cytoscape software을 이용하여 분석하였고, 공개 데이터베이스인 BreastMark를 통해 얻은 각 아형별 유방암 환자의 생존율 정보를 활용하여 비스페놀A에 의한 상이 발현 유전자와의 상관관계를 분석하였다. 2. 비스페놀A 노출이 유방암의 진행에 미치는 영향을 확인하기 위해 세포실험에서 유방암 초기단계의 특성을 가지는 관상피내암세포인 MCF10DCIS.com과 종양면역환경에서 높은 분포도를 보이며 다양한 역할을 하는 대식세포인 RAW264.7을 사용하였다. 이 단계에서 엠티티 분석과 0.8 µm 트랜스웰 이동 분석법으로 비스페놀A 노출에 의한 암세포와 대식세포의 증식 및 이동 능력을 평가하였고, 이에 관여하는 암세포 내 신호전달기전 분석은 웨스턴블럿을 수행하였다. 실시간 역전사중합효소연쇄반응법과 웨스턴블럿을 수행하여 비스페놀A 노출에 의한 대식세포의 면역기능을 분석하였다. 또한 암세포 및 대식세포를 72시간 배양한 조건부 배지 처리 혹은 0.4 µm 트랜스웰 이용한 공동 배양을 통하여 암세포와 대식세포의 상호작용을 분석하였다. 유방암 초기단계에 대한 종양이식모델은 3주령의 면역 결핍 마우스 (BALB/c nude)를 한 달간 비스페놀A에 음수 노출시킨 후 마우스의 2번째 유선지방조직에 루시퍼라제 발현 MCF10DCIS.com 세포를 이식하여 생체발광영상 기법으로 종양의 성장과 전이를 추적하였다. 이후 조직면역 염색을 통해 일차 종양 조직과 종양주변의 림프절 조직에서 대식세포마커인 F4/80과 염증성 M1 마커인 NOS2, 종양친화성 M2 마커인 CD206, 그리고 림프절 내에 전이된 유방암세포를 감지하는 CK5의 발현을 확인하여 종양관련 대식세포의 면역기능과 전이 여부를 분석하였다. 결과: 1. 장기간 저용량의 비스페놀A에 노출된 MCF-7, SK-BR3, MDA-MB-231 세포들의 전사체 발현 변화를 분석한 결과, NKT, NK and T cell activation과 dendritic cell migration 등의 면역기능 변화와 관련된 유전자가 공통적으로 확인됐다. 이러한 결과를 바탕으로 유방암 아형별 환자의 생존율 데이터를 분석하여 비스페놀A에 의한 면역관련 상이 발현 유전자의 발현 증가가 유방암 환자의 생존율 감소와 상관관계를 검증하였다. 2. 마찬가지로 저용량 비스페놀A에 노출된 MCF10DCIS.com 세포의 전사체 분석 결과에서도 면역 관련 변화가 보여졌다. 저용량 비스페놀A 노출은 MCF10DCIS.com 세포의 증식과 이동을 유도하였고, RAW264.7 세포의 이동과 NOS, CD206, arginase-1의 발현을 증가시켜 M1과 M2형의 분극화를 유도하였다. MCF10DCIS.com 세포를 이식한 유방암 마우스 모델에서 저용량의 비스페놀A에 의해 일차암 주변의 종양 관련 대식세포들은 CD206을 발현하는 M2형의 분포도가 유의하게 증가하였으며, 종양의 성장과 림프절 전이가 촉진되었다. 결론: 1. 본 연구결과는 지속적인 저용량 비스페놀A 노출이 각 유방암 아형의 세포주의 면역조절을 포함하여 다양한 생물학적 기능과 유전자 발현 조절에 다른 영향을 미침을 시사한다. 2. 본 연구결과는 비스페놀A 노출이 대식세포의 종양친화적(protumorigenic) 분극뿐만 아니라 DCIS 세포의 증식 및 이동능력에 영향을 주어 침윤성 유방암으로의 진행을 가속시키는 촉진제 역할을 함을 시사한다.