연골재생을 위한 혈소판 풍부 혈장의 보관조건, 조성 및 적용

Abstract

Purpose: The purpose of this study was to investigate the practical use of platelet‐rich plasma (PRP) for cartilage regeneration. For this purpose, the author evaluated 1) the concentrations of growth factors in PRP, depending on the storage conditions; 2) the effects of leukocyte concentrations in PRP on the proliferation and chondrogenesis of synovial membrane-derived mesenchymal stem cells (SDSCs) and chondrocytes; and 3) in vivo effectiveness of PRP with a hyaluronic acid (HA) hydrogel for cartilage regeneration.

Materials and Methods: To evaluate growth factor concentration in PRP based on storage conditions, PRP samples were stored at 24℃ (room temperature group), 4℃ (refrigerator group), and −70℃ (deep‐freezer group). In each temperature, four aliquots were prepared based on the time of analysis (immediately, 1, 3, 7 days after preparation). After storage, concentrations of platelet‐derived growth factor‐AA (PDGF‐AA), transforming growth factor‐β (TGF‐β), vascular endothelial growth factor (VEGF), insulin‐like growth factor‐1 (IGF‐1), and fibroblast growth factor‐basic (FGF‐B) were assessed with/without activation using Quantikine colorimetric sandwich immunoassay kits. PRP was activated with 10% Triton‐X for PDGF‐AA, VEGF, FGF‐B, IGF‐1 measurement and sonication for TGF‐β1 measurement. To evaluate the effect of leukocyte concentrations in PRP on the proliferation and chondrogenesis of SDSCs and chondrocytes, we prepared two PRP formulations: (1) leukocyte-poor PRP (P-PRP) and (2) leukocyte-rich PRP (L-PRP). SDSCs and chondrocytes were obtained by enzymatic digestion of synovial tissues and the cartilage from a knee joint undergoing total knee arthroplasty. The primary cells were expanded in Dulbeccos modified Eagles medium supplemented with fetal bovine serum (FBS), L-PRP, or P-PRP. Cell proliferation was measured using the MTT assay. SDSCs and chondrocytes were cultured with chondrogenic medium (CM) only, CM with L-PRP, or CM with P-PRP using a high-density pellet culture system for 3 weeks. The expression of chondrogenesis-related genes (type II collagen, type X collagen, aggrecan, and SOX-9) were analyzed by RT-qPCR. Pellets were stained with safranin-O for proteoglycan detection. The expression of type II collagen was detected by immunohistochemical staining. To evaluate the effect of PRP in combination with the HA hydrogel on in vivo cartilage regeneration, eighteen rabbit osteochondral defect models (round shape defect in the femoral trochlear groove with 4 mm in radius and 3 mm in depth) were made and divided into 3 groups: control group, in which the defect was left untreated; HA group, in which the defect was filled with the HA hydrogel; and HA-PRP group, in which the defect was filled with HA hydrogel and PRP. After 12 weeks, tissue specimens were assessed by macroscopic examination, histological evaluation, and by measuring the glycosaminoglycan (GAG) content.

Results: Regarding growth factor concentration in PRP based on storage conditions, PDGF‐AA concentration was highest on day 7 in the room temperature group without activation. With activation, the concentration of PDGF‐AA was constant over the observation period at all temperatures. Without activation, the TGF‐β1 concentration remained negligible over the observation period at all temperatures. However, with activation, TGF‐β1 concentration was highest on day 7 at all temperatures. Over the observation period, VEGF and IGF‐1 concentration were constant with and without activation at all temperatures. Without activation, FGF‐B concentration was highest on day 7 in the deep‐freezer group. With activation, FGF‐B concentration decreased after day 1 in the room temperature group. Regarding the effect of the leukocyte concentration in PRP on the proliferation and chondrogenesis of SDSCs and chondrocytes, L-PRP showed a stronger proliferative effect on both types of cells than P-PRP and FBS. Meanwhile, RT-qPCR revealed higher cartilage-related gene expression in SDSCs and chondrocytes in the P-PRP group compared with that in the L-PRP and CM groups. However, SDSCs and chondrocytes in both PRP groups showed weaker safranin-O staining than those in the CM group. In immunohistochemical analysis, positive staining of SDSCs were not observed in either of the PRP groups and staining of chondrocytes in both PRP groups were weaker than those in the CM group. Regarding the effect of PRP combined with the HA hydrogel on in vivo cartilage regeneration, the macroscopic ICRS scores were not different among the three groups. The HA and HA-PRP groups showed significantly higher microscopic ODriscoll scores and a significantly higher GAG content than the control group, although the values were not different between the HA and HA-PRP groups.

Conclusion: The growth factor concentrations significantly differed in PRP, depending on the storage temperature, duration of storage, and activation. Regardless of the leukocyte concentration, PRP showed a negative effect on chondrogenesis of SDSCs and chondrocytes. In addition, a combined use of the HA hydrogel and PRP did not show better chondrogenic effects in vivo compared with those of the HA hydrogel alone. Considering the results of our study, a further study is necessary to clarify the ideal composition and application of PRP for cartilage regeneration.

목 적: 본 연구에서는 혈소판 풍부 혈장을 이용한 연골재생에 대해 알아보고자 한다. 이를 위해 먼저 보관조건에 따른 혈소판 풍부 혈장 내 성장인자 농도를 조사하고, 혈소판 풍부 혈장 내 백혈구 농도 차이가 인체활막세포와 연골세포에 미치는 영향을 알아본 후, 마지막으로 혈소판 풍부 혈장과 지지체의 복합체 형성이 연골재생에 미치는 영향을 알아보았다.

대상 및 방법: 보관조건에 따른 혈소판 풍부 혈장 내 성장인자 농도를 조사하기 위해, 혈소판 풍부 혈장을 24도, 4도, -70도에서 7일 동안 보관한 후 활성화 전후로 PDGF‐AA, TGF‐β, VEGF, IGF‐1, FGF‐B 농도를 ELISA를 이용하여 측정하였다. 또한 혈소판 풍부 혈장 내 백혈구 농도 차이가 인체활막세포와 연골세포에 미치는 영향을 알아보기 위해, 백혈구 풍부 (Leukocyte-rich)와 순수 (Leukocyte-poor) 혈소판 풍부 혈장을 제조하고 이들을 각각 인체활막세포, 연골세포와 같이 3주간 pellet 배양하였다. 이후 세포 증식을 MTT assay로 평가하고, 연골형성능은 RT-PCR로 연골형성에 관련된 유전자 (Type II collagen, Type X collagen, SOX-9, aggrecan) 발현을 측정한 후 조직학/면역학적 염색을 시행하였다. 마지막으로 혈소판 풍부 혈장과 지지체의 복합체 형성이 연골재생에 미치는 영향을 조사하기 위해, 토끼 대퇴 활차에 골연골 결손을 만들고 대조군, 지지체군, 복합체군 (혈소판 풍부 혈장+지지체)으로 나눈 후 12주에 ICRS macroscopic score와 Modified ODriscoll score를 얻고 DMB assay를 통해 GAG 합성을 평가하였다.

결 과: 보관조건에 따른 혈소판 풍부 혈장 내 성장인자 농도의 경우, 활성화 전 PDGF‐AA 농도는 24도에서 7일째 가장 높았고, TGF‐β는 모든 온도에서 7일 동안 잘 검출되지 않았으며, VEGF와 IGF‐1 농도는 모든 온도에서 7일 동안 일정하게 유지되고, FGF‐B 농도는 -4도에서 7일째 가장 높았다. 활성화 후 PDGF‐AA, VEGF, IGF‐1 농도가 모든 온도에서 7일 동안 일정하게 유지된 것에 반해, TGF‐β 농도는 모든 온도에서 7일에 가장 높았고, FGF‐B 농도는 24도에서 1일 후 급격히 감소하는 양상을 보였다. 혈소판 풍부 혈장 내 백혈구 농도 차이가 인체활막세포와 연골세포에 미치는 영향의 경우, 백혈구 풍부 혈소판 풍부 혈장에서 인체활막세포와 연골세포 모두 보다 큰 증식능력을 보였으나, RT-PCR의 경우 두 세포 모두 백혈구 순수 혈소판 풍부 혈장에서 보다 많은 유전자 발현이 관찰되었다. 하지만 인체활막세포와 연골세포의 조직학/면역학적 염색상, 백혈구 농도에 관계없이 두 혈소판 풍부 혈장 모두에서 연골 분화가 억제되는 양상이 관찰되었다. 혈소판 풍부 혈장과 지지체의 복합체 형성이 연골재생에 미치는 영향의 경우, 세군 모두에서 ICRS macroscopic score에 차이가 없었다. Modified ODriscoll score와 GAG 농도의 경우, 지지체군과 복합체군 모두 대조군보다 높았으나, 두 군 간에는 차이가 관찰되지 않았다.

결 론: 혈소판 풍부 혈장에서 방출되는 성장인자들의 농도는 보관온도, 보관기간, 활성화 여부에 따라 큰 차이가 있었다. 또한 혈소판 풍부 혈장 내 백혈구 농도에 관계없이 혈소판 풍부 혈장은 인체활막세포와 연골세포의 연골형성에 부정적인 영향을 보였으며, 혈소판 풍부 혈장과 지지체의 복합체 사용은 지지체 단독 사용에 비해 향상된 연골형성으로 이어지지 못했다. 이번 연구결과들을 기반으로 연골재생을 위한 최적의 혈소판 풍부 혈장 사용에 대한 추가연구가 필요 할 것으로 생각된다.