Structural studies on the β-arrestin2 in complex with a CXCR7 C-terminal phosphopeptide to reveal the active conformation of β-arrestin2, and structural and functional studies on Pgp3 from intestinal pathogen Campylobacter jejuni, playing a key role in helical cell shape

Abstract

The dissertation focuses on gaining a molecular level of understanding of how ligand recognition affects the alteration of protein structure and function. The dissertation is divided into two research chapters. Chapter 1 discusses one of the important cell-signaling regulating proteins, β-arrestin 2 (βarr2) to obtain the molecular level of understanding for the G-protein coupled receptor (GPCR) recognition. Chapter 2 discusses one of the cell-shape determining (Csd) proteins called peptidoglycan peptidase 3 (Pgp3) from Campylobacter jejuni. The molecular level of studies for the peptidoglycan recognition of Pgp3 protein can perhaps provide us with an insight into the mechanism for host infection of the pathogen. In Chapter 1, the structural and biophysical studies on the active conformation of βarr2 will be discussed. βarrs critically regulate signaling and trafficking of GPCRs, and there are two isoforms of βarrs: βarr1 and βarr2. GPCRs are the largest family of receptors on cell membranes and comprise an important class of drug targets. To turn off G-protein-mediated GPCR signaling, GPCR kinases phosphorylate the C-terminal tail and/or intracellular loops of GPCRs, which leads to arrestin binding. To date, the high-resolution structure of active βarr1 in complex with a phosphopeptide derived from GPCR has been revealed, but that of βarr2 remains elusive. To understand the recognition of the phosphorylated carboxyl-terminus tail of GPCR by the βarr2 protein, we determined a crystal structure of Rattus norvegicus βarr2 in complex with a phosphopeptide (C7pp) derived from CXCR7, a class A GPCR. The crystal structure of C7pp-bound βarr2 reveals key differences from the previously determined active conformation of βarr1. One of the key differences is that C7pp-bound βarr2 shows a relatively small inter-domain rotation. To prove the active conformation of βarr2, we used hydrogen/deuterium exchange mass spectrometry (HDX-MS) and synthetic-antibody-based conformational sensors. In Chapter 2, the structural and functional studies on the Pgp3 protein from C. jejuni will be discussed. The helical cell shape of C. jejuni is important for bacterial colonization during the infection of human intestines, which is believed to be due to the specific type of crosslinking of peptidoglycan. Via the remodeling of peptidoglycan by Csd proteins, the C. jejuni has sustained its adeptness at colonization and pathogenesis. To understand how Csd proteins recognize peptidoglycan, we solved eight X-ray crystal structures of Pgp3 including two complex structures bound with peptidoglycan derivative substrates. In addition, functional characterization of Pgp3 by the turnover chemistry revealed that it contains both D,D-endopeptidase and D,Dcarboxypeptidase activities. Catalysis is accompanied by large conformational changes upon peptidoglycan binding, whereby a loop regulates access to the active site. Furthermore, prior hydrolysis of the cross-linked peptide stem, which stems from the saccharide backbone of the peptidoglycan on one side, is a pre-requisite for its recognition and turnover by Pgp3. These analyses reveal the noncanonical nature of the transformations at the core of the events that define the morphological shape for C. jejuni as an intestinal pathogen.

본 논문은 리간드 인식이 단백질 구조 및 기능의 변화에 어떻게 영향을 미치는지에 대한 분자 수준의 이해를 얻는 데 중점을 둔다. 본 논문은 두 개의 장으로 나뉜다. 제1장에서는 G-단백질 결합 수용체 (GPCR) 인식에 대한 분자 수준의 이해를 얻기 위해 중요한 세포 신호 조절 단백질인 β-arrestin (βarr)을 설명한다. 제2장에서는 C. jejuni의 세포 모양 결정 (Csd) 단백질 중 하나인 펩티도글리칸 분해효소 3 (Pgp3)에 대해 논의한다. Pgp3 단백질의 펩티도글리칸 인식에 대한 분자 수준의 연구는 병원체의 숙주 감염 메커니즘에 대한 통찰력을 갖게 할 것이다. 제1장에서는 βarr2의 구조적 및 생물 물리학적 연구에 대해 다룬다. βarr은 GPCR의 신호 전달 및 이동을 조절하는데 중요하며, βarr은 βarr1과 βarr2 이렇게 두 가지 동위체가 존재한다. GPCR은 세포막 수용체 중에서 가장 큰 패밀리를 가진 수용체이며, 약물 표적에 주요 단백질이다. G-단백질 매개 GPCR 신호 전달을 끄기 위해서, GPCR 인산화 효소는 GPCR의 C-말단 꼬리 및/또는 세포 내 존재하는 루프를 인산화 시켜, βarr와의 결합을 초래한다. 현재까지, GPCR의 C-말단 꼬리로부터 유래된 인산화 펩타이드와 활성형 (activated) βarr1의 고해상도 복합체 구조가 밝혀졌지만, βarr2와의 복합체 구조는 밝혀져 있지 않았다. βarr2 단백질에 의한 GPCR의 인산화 된 카복실-말단의 인식을 분자적으로 이해하기 위해, class A GPCR인 CXCR7 수용체의 C-말단에서 유래된 인산화 펩타이드 (C7pp)와 βarr2 단백질의 복합체 결정 구조를 규명하였다. C7pp와 결합된 βarr2의 구조는 기존에 밝혀진 βarr1 활성형 구조와 주요한 차이점을 보인다. 주요 차이점 중 하나는 C7pp와 결합된 βarr2의 구조가 비교적 작은 도메인 (N-도메인과 C-도메인) 간 회전을 나타낸다는 것이다. 또한, 본 연구에서 규명한 βarr2의 CXCR7 인산화 펩타이드 복합체 구조가 활성형임을 확인하기 위하여 수소/중수소 교환 질량 분석법 (HDX-MS) 및 합성 항체 기반 입체 구조 센서를 사용하였다. 제2장에서는 C. jejuni의 Pgp3 단백질에 대한 구조적 및 기능적 연구가 논의된다. C. jejuni의 나선형 세포 모양은 사람의 장 내 감염을 위해 박테리아 군집형성에 중요하며, 나선형 세포 모양은 펩티도글리칸의 특정 유형의 가교 결합으로 인한 것으로 여겨진다. Csd 단백질에 의한 C. jejuni의 펩티도글리칸 리모델링을 통해, C. jejuni는 박테리아 군집화 및 발병 기전에 적합하도록 세포의 모양을 유지하게 된다. Csd 단백질이 펩티도글리칸을 인식하는 방법을 이해하기 위해, 서로 다른 2가지의 펩티도글리칸 유도체 기질이 결합된 서로 다른 복합체 구조 2개를 포함하여 총 8개의 Pgp3 단백질의 X-선 결정 구조를 규명하였다. 또한, Pgp3 단백질은 펩티도글리칸 세포벽에 대해 D,D-endopeptidase와 D,D-carboxypeptidase 활성이 있음을 밝혔다. Pgp3의 촉매 작용은 펩티도글리칸에 결합할 때 큰 구조적 변화를 동반하는 것으로 나타났는데, 특히 Pgp3의 루프가 기질이 활성 부위에 접근하는데 조절함을 밝혔다. 또한, 한쪽의 펩티도글리칸의 당류 골격으로부터의 가교 된 펩티드 줄기의 가수 분해는 Pgp3에 의한 펩티도글리칸의 인식 및 촉매 작용을 위한 전제 조건임을 유추할 수 있었다. 이러한 분석은 사람의 장내 병원체인 C. jejuni의 병원성을 정의하는 핵심이 세포 모양 형태라는 점에서 비전형적 특성을 나타낸다는 것을 말한다.