Angelica tenuissima Nakai: Promotion of Osteo/Odontoblastic Differentiation of Human Periodontal Ligament Stem Cells and Antiviral Property against Influenza Virus, in vitro

Abstract

Objectives Angelica tenuissima Nakai (ATN) is a herbal medicine used in the treatment of toothache, headaches, and cold symptoms, Published research to date has not systematically explored the therapeutic effects of ATN. The purpose of this study is to investigate the effects of ATN on alleviating toothache and cold symptoms.

Methods Effects of ATN on the proliferation and differentiation of hPDLSCs were evaluated using MTT assay, Alizarin red S staining, real-time PCR and western blotting. The roles of ATN during dentin-like structure formation was investigated using hPDLSCs mixed with treated dentin matrix either with or without ATN. An animal study was, additionally, performed with subcutaneous cell suspension and scaffold transplantation into immunocompromised mice. For determining the antiviral property of ATN against influenza virus (H1N1, H3N2), time of addition assay, microscopic examination, influenza virus-ATN binding assay and real-time PCR were performed.

Results Angelica tenuissima Nakai promoted osteo/odontoblastic differentiation of hPDLSCs, accelerated mineral nodule formation in vitro and displayed no toxicity at higher concentrations. The mRNA expression levels of ALP, COL1, OPN, DMP1, DSPP in hPDLSCs, and the protein levels of OCN, DSPP, DMP1, Runx2 were significantly increased with ATN treatment. Osterix (OSX) gene overexpressed-HEK 293 cells, treated with ATN (100 μg/ml), showed an increase in BSP promoter activity. No apparent osteogenesis was observed in both control and experimental groups in vivo. Antiviral properties of ATN were observed against the H1N1 and H3N2 viruses. Microscopy also confirmed an increased survival rate of the host cells. The addition of ATN before virus adsorption showed similar results with whole period treatment. The pre-treated group and co-treated group showed a lower level of viral RNA (M1 protein).

Conclusion The results of this study suggest that ATN promotes osteo/odontoblastic differentiation of hPDLSCs and has an antiviral property against influenza virus. These therapeutic properties of ATN can serve as the theoretical basis for further research on the applicability of ATN in periodontal tissue regeneration and antiviral agent development.

1. 목 적 한고본은 치통, 두통, 감기증상의 치료에 사용되는 한약재로 그 효과에 대한 연구가 자세히 이루어지지 않았다. 특히 치통과 감기증상 치료에 대한 근거는 확실하지 않은 상태이다. 본 논문은 한고본이 지니는 이 효능에 대해 규명하고자 두 가지 방법으로 연구를 진행하였다. 치주질환은 가장 흔한 만성질환으로 이를 치료하기 위해 많은 연구가 이루어져 왔다. 치주조직은 치통을 일으키는 가장 흔한 원인으로 치조골 파괴를 동반하여 동통을 유발한다. 한고본이 파괴된 경조직 재생효과를 통해 통증을 조절할 것이라는 가설 하에 사람치주인대줄기세포를 이용하여 한고본의 효과를 알아보았다. 한고본은 감기의 치료에 이용되는 약물로서 그 기전을 살펴보기 위해 influenza virus에 대한 항바이러스효과를 검증하고자 하였다.

2. 방 법 성인에서 발치된 제3대구치의 치주인대 조직에서 줄기세포를 얻었다. 배양한 줄기세포를 유세포 분석과 골모세포, 연골세포, 지방세포로의 분화를 통하여 줄기세포 표지자 및 다분화능을 확인하였다. Cell proliferation 에 미치는 영향을 보기위해 MTT test와 Cell migration test를 시행하였으며 독성을 가지지 않는 여러 농도에서 골분화를 유도 하였다. Alizarin red staining 염색을 통해 광화를 확인하였고 이후 real-time PCR 및 western blot을 통해 다양한 표지자를 확인하였다. Osterix를 과발현한 세포에 한고본이 미치는 영향을 확인하기 위해 형질주입과 발광효소 분석을 시행하였다. 동물실험을 위해 누드마우스의 피하에 한고본을 처리하거나 처리하지 않은 치주인대 줄기세포와 treated dentin matrix을 이식하고 8주 뒤에 H&E stain을 통해 효과를 확인하였다. H1N1, H3N2 virus에서 한고본의 항바이러스 효과를 보기위해 MDCK cell 에 MTT assay를 시행하고 CC50을 구하였으며 바이러스 역가 측정을 위해 Hemagglutination inhibition assay와 TCID50를 시행하였다. time of addition assay, microscopic examination, influenza virus-ATN binding assay, real-time PCR 이 시행되었다.

3. 결 과 사람치주인대줄기세포에 대해 유세포 분석을 시행한결과 중간엽 유래 줄기세포의 표지자(CD13+, CD90+, CD146+, CD34-)를 확인하였으며 분화유도를 시행했을 때 골조직, 연골조직, 지방조직으로 분화가 가능함을 확인하였다. MTT assay에서 200 µg/mL 까지는 세포독성이 나타나지 않았으며 Cell migration test에서는 대조군과 특별한 차이는 보이지 않았다. 또한 100 µg/mL의 농도에서 치주인대줄기세포의 광화가 더 촉진되었다. real-time PCR을 시행하였을 때 Alkaline Phosphatase(ALP), Dentin Matrix protein (DMP1), type 1 collagen (COL1), Osteopontin (OPN), Dentin Sialophosphoprotein(DSPP)의 증가를 확인하였다. Western blot 에서는 osteocalcin (OCN), dentin sialophosphoprotein (DSPP), dentin matrix protein (DMP1), Runt-related transcription factor 2 (Runx2) 단백질이 증가하였다. 형질주입과 발광효소분석에서는 Osterix DNA를 과활성화한 293 cell에 한고본을 처리했을 때 Bone Sialoprotein (BSP) promotor 활성이 증가하는 경향을 확인하였다. 누드마우스를 이용한 동물실험에서는 대조군과 실험군 모두에서 골화는 관찰되지 않았다. ATN은 H1N1, H3N2 virus에 대해서 항바이러스 성질을 나타내었다. 현미경 결과에서 더 많은 세포가 살아남음을 확인하였고 바이러스 처리 전에 ATN을 처리한 그룹에서 전 기간 동안 처리한 그룹과 유사한 억제 효과를 보여주었다. 바이러스 처리 전, 바이러스와 동시에 ATN을 처리한 군에서 대조군보다 낮은 viral RNA(M1 protein) 수준을 보여주었다.

4. 결 론 한고본은 사람치주인대 줄기세포의 조골세포/조상아세포 분화 촉진 효과를 나타냈으며 인플루엔자 바이러스에 대해서 항바이러스 성질을 보여주었다.