Dentin-Pulp Regeneration using Autologous Fibrin Matrix in Human Dental Pulp Stem Cells

Abstract

Background and Purpose of the Study Xenogeneic serum is widely used as a growth supplement for cell culture medium; however, animal-borne pathogens increase the risk of transmitting infectious agents. Human autologous supplements, including platelet derivatives such as platelet-rich fibrin (PRF), have been assessed in clinical studies as a possible replacement for fetal bovine serum. However, concentrated leukocytes may affect catabolic gene expression in tendons and ligaments, and concentrated red blood cells (RBCs) cause inflammation due to numerous pro-inflammatory interleukins. It was hypothesized that minimizing the number of leukocytes would contribute to the differentiation activity of human dental pulp stem cells (hDPSCs). This study aimed to explore the ability of autologous fibrin (AF) serum prepared after leukocyte removal to induce the differentiation of hDPSCs in vitro and in vivo.

Materials and Methods Human DPSCs were obtained from extracted third molars. To characterize the immunophenotype of the hDPSCs, the expression of mesenchymal stem cell-associated surface markers at passage 5 was analyzed by flow cytometry. Next, AF was prepared by high-speed centrifugation and most of the leukocytes were removed. The AF serum was then subjected to three freeze-thaw cycles and used in vitro for the cell culture. hDPSCs were treated with AF serum, and then odontogenic-associated markers were investigated by real-time polymerase chain reaction (PCR). For the in vivo experiments, autologous fibrin matrix (AFM) was fabricated on a plate and hDPSCs cultured on the AFM formed a cell-fibrin complex. Then, the potency of the differentiation induction of the hDPSCs in the cell-fibrin complex was evaluated via real-time PCR and Western blot. The hDPSCs mixed with a cell-fibrin complex were subcutaneously transplanted into nude mice and allowed to grow for 8 weeks. Then, the cell-fibrin complex was examined how induced odontoblastic differentiation and dentin formation of the hDPSCs in the mice by immunohistochemical (IHC) analysis.

Results Flow cytometric analysis showed that approximately 90% or more of the hPDLSCs expressed CD13, CD90, and CD146, and 1.58% expressed CD34. The multi-lineage differentiation capacity of hDPSCs in vitro in osteogenic, chondrogenic, and adipogenic medium was observed. Scanning electron microscopy (SEM) images verified that leukocytes were almost absent from the fibrin matrix after high-speed centrifugation. A cytokine array showed that AF serum released sufficient cytokines to induce the differentiation of hDPSCs. AF serum accelerated mineral nodule formation in vitro and increased the expression of odontoblast-associated genes, such as alkaline phosphatase (ALP), bone sialoprotein (BSP), dentin matrix protein 1 (DMP1), dentin sialophosphoprotein (DSPP), runt-related transcription factor 2 (Runx2), and vascular endothelial growth factor (VEGF). In addition, the cell-fibrin complex also was observed that it significantly up-regulated the levels of the proteins DMP1, osteopontin (OPN), and DSPP during odontogenic differentiation. Furthermore, IHC staining revealed proteins were expressed after the transplantation of the hDPSCs and the cell-fibrin complex induced the hDPSCs to differentiate into odontoblasts-like cells and to regenerate dentin-pulp tissue in vivo.

Conclusions The present study investigated the potential safe methods to expand autologous cells in a risk-free environment, and the cell-fibrin complex scaffold could be generated without the introduction of foreign scaffold materials. The results of experiments confirmed that 1. AF serum prepared after removal of leukocytes to could be used for the proliferation and promotion of hDPSCs odontogenic differentiation under animal serum-free conditions. 2. Human DPSCs cultured on the AFM formed a cell-fibrin complex which became stable and secreted their own matrix to form an autogenous 3D structure. 3. AFM can be effectively used as a carrier for successful regeneration of dentin-pulp complexes, which has been demonstrated by the in vivo subcutaneous transplantation in nude mice. 4. As a clinical implication, AFM possesses good bio-compatibility and cell infiltration and is suitable for dental tissue regeneration in hDPSCs.

1. 연구목적 사람치아줄기세포를 배양 시 이종첨가제를 주로 사용하여 왔는데 이는 이종 기원이기 때문에 동물성 병원체 등의 감염원을 지닐 가능성이 있다. 최근 fetal bovine serum (FBS)를 대체하기 위한 임상 연구에서 혈소판 풍부 피브린 (Platelet rich fibrin; PRF)과 같은 혈소판 유도체를 포함한 인간 자가 보충제가 많이 연구되었다. 그러나 PRF는 농축된 백혈구와 적혈구를 함유하고 있으며, 그중 백혈구는 건(tendon)과 인대(ligament)에서 유전자 발현에 영향을 줄 수 있고, 적혈구는 염증반응을 촉진하는 인터루킨을 다량 함유하기 때문에 의도치 않은 염증이 유발될 수 있다고 보고되어왔다. 하여 백혈구 수를 최소화하면 인간치아 치수줄기세포 (human dental pulp stem cells; hDPSCs)의 분화에 기여할 것이라고 가설을 세웠다. 이에 본 연구를 통해 백혈구를 제거한 자가 피브린으로 체외 및 생체 내에서 사람치아 치수줄기세포 의 분화를 유도하는 능력에 대해 알아보고자 한다.

2. 연구방법 발거된 제3대구치의 치수조직에서 사람 치수줄기세포를 추출하였으며, 이를 대상으로 줄기세포 특성을 조사하였다. 사람 혈액을 고속 원심 분리하여 자가 피브린을 만들었고 그 피브린 추출물로 in vitro 실험을 위한 세포 배양에 사용되었으며, 또한 자가 피브린 매트릭스를 사용하여 in vivo 실험을 시행하였다. 우선, 혈액을 원심 분리하여 얻은 자가 피브린 매트릭스에서 백혈구가 제거되었는지 확인하기 위하여 조직학적 분석 및 주사전자현미경(scanning electron microscopy; SEM) 촬영을 통해 확인하였고, 사람 치수줄기세포에 자가 피브린 추출물을 처리한 뒤 qRT-PCR (quantitative real-time polymerase chain reaction)을 통해 치성 관련 유전자 발현을 조사하였다. 그리고 치수줄기세포를 자가 피브린 매트릭스 위에서 배양하여 줄기세포-피브린 매트릭스 혼합체를 얻어 그 효능을 Western blot을 통해 평가하였다. in vivo 환경에서의 영향을 확인하기 위해 누드마우스를 대상으로, 실험군으로 치수줄기세포와 자가 피브린 매트릭스 혼합체를 한 쪽 피하에 이식하였고, 대조군으로 자가 피브린 매트릭스를 실험군 반대편에 이식하였다. 8주 후 이식한 조직을 채취하여 상아질모세포(odontoblast) 분화와 상아질모세포에 의한 상아질 생성 및 특정된 단백질 발현을 immunohistochemistry로 비교 확인하였다.

3. 연구결과 유세포 분석 결과 치수줄기세포 표지인자인 CD13, CD90, CD146이 발현 되었으며, 분화를 통해 다중 분화 능력이 있는 줄기세포의 특징을 가지고 있음을 확인하였다. 조직학적 분석과 SEM으로 확인한 결과 자가 피브린 매트릭스에서 백혈구는 거의 확인되지 않았다. In vitro에서 자가 피브린 추출물은 경조직 분화 마커인 alkaline phosphatase (ALP), bone sialoprotein (BSP), dentin matrix protein 1 (DMP1), dentin sialophosphoprotein (DSPP), runt-related transcription factor 2 (Runx2), vascular endothelial growth factor (VEGF)의 발현이 증가한 것을 확인하였다. 또한 줄기세포-매트릭스 혼합체는 상아질모세포의 분화과정에서 DMP1, osteopontin (OPN) 및 DSPP의 단백질 발현을 유의하게 촉진함을 확인할 수 있었다. 누드마우스의 피하에 이식한 매식체의 조직학적 분석결과 대조군에 비해 치수줄기세포와 자가 피브린 매트릭스 혼합체의 이식군에서 상아질 특정 단백질이 더욱 강하게 염색되었으며, 상아질-펄프 조직이 재생되어 있음을 확인하였다.

4. 결론 이 연구는 무위험 환경에서 자가 세포를 확장시키는 잠재적인 안전한 방법을 조사했으며, 세포 스캐폴드 복합체는 외인성 물질의 도입없이 치아 조직이 생성 될 수 있다. 1. 자가 피브린 추출물은 백혈구를 제거한후 제조되었으며 동물 무 혈청 조건하에 치아줄기세포의 증식과 분화에 유용하게 이용가능하다. 2. 자가 피브린 매트릭스에서 배양된 치아줄기세포는 세포-피브린 복합체를 형성하였으며, 이는 안정적이고 3차원적인 자가 매트릭스 구조를 형성하였다. 3. 자가 피브린 매트릭스는 생체 내 누드마우스 피하에 이식하여 상아질-펄프 복합체의 성공적인 재생에 우수한 운반체로서 유용하게 이용할 수 있음이 입증되었다. 4. 임상적 의미에서 자가 피브린 매트릭스는 우수한 생체 적합성 및 세포 침윤을 보유하며 치아줄기세포에서 치아조직 재생에 유용하다는 것을 알 수 있다.