Chemokine induction through Toll-like receptor 3 in human dental pulp cells

Abstract

Objectives Human dental pulp cells (human DPCs) in pulp cavity have mesenchymal stem cell properties and are capable of differentiating into odontoblasts, adipocytes, chondrocytes, osteoblasts and neurons. Human DPCs, once exposed to microorganisms in the oral cavity by dental caries, dental trauma and dentinal tubule exposure, which in turn trigger inflammatory responses against microbe-associated molecular patterns (MAMPs) resulting pulpitis. During the development of pulpitis, inflammatory mediators including IL-1, IL-6, IL-8, TNF-α and MMP-9 contribute to pathogenesis. In the oral cavity, various viruses exist and can lead to several infectious diseases. When pulp tissues are exposed to oral microorganisms, some oral viruses can stimulate DPCs likely using their MAMPs. However, the understanding immune responses of human DPCs induced by viral infection is limited. In this study, the immunological properties of human DPCs against viral double-stranded RNA (dsRNA) were investigated.

Methods All experiments using human DPCs were conducted under the approval of the Institutional Review Board of the Seoul National University (S-C20200023). To determine the expression of pattern-recognition receptors (PRRs) which are essential for the recognition of MAMPs, the mRNA expression of Toll-like receptors (TLRs) in human DPCs was analyzed by real-time RT-PCR. In this study, synthetic poly(I:C), mimicking viral dsRNA, was used as a model for RNA viral infection. To investigate the expression of poly(I:C)-induced inflammatory cytokines, the expressions of IL-8, CXCL10, CCL2, CCL5, CCL20, IFN-β, IL1-β, IL-6 and TNF-α were analyzed by real-time RT-PCR. In addition, the productions of IL-8, CXCL10, CCL2, IL-1β, IL-6 and TNF-α were measured by ELSIA. To knock down TLR3, human DPCs were transfected with TLR3 siRNA, and subsequently, stimulated with poly(I:C) followed by determination of the expression of IL-8 with real-time RT-PCR and ELISA. To elucidate the signaling pathway activated by poly(I:C), human DPCs were pre-treated with MAP kinase inhibitors, SB203580, SB202190, PD90859, ERK inhibitor II, SP600125 or JNK inhibitor II, for 1 h, and then stimulated with poly(I:C) for additional 24 h. To determine which transcriptional factors are essential for poly(I:C)-induced IL-8 expression in human DPCs, the cells were transfected with luciferase reporter gene of which the expression is regulated by human IL-8 promoter (-132/+42)/pGL3 wild type (WT), mutant (mut) AP-1, mut C/EBPβ and mut NF-κB, respectively, and then the promoter activity induced by poly(I:C) was analyzed by luciferase assay.

Results Among TLRs (1-10) tested, TLR3 was the most highly expressed in human DPCs. Poly(I:C) potently induced IL-8 expression in a time- and dose-dependent manner. Besides, the expressions of CXCL10, CCL2, CCL5, CCL20, IFN-β and IL-6 were substantially increased by poly(I:C) in human DPCs while IL1-β and TNF-α were not detected. To determine whether the expression of poly(I:C)-induced inflammatory cytokines is dependent on TLR3, human DPCs were transfected with TLR3 siRNA and then stimulated with poly(I:C). human DPCs transfected with TLR3 siRNA showed a decreased IL-8 production compared with non-targeting siRNA-transfected cells. In addition, the expressions of cytoplasmic dsRNA receptors, RIG-1 and MDA5, were significantly increased by poly(I:C) stimulation. To investigate the signaling pathway involved in poly(I:C)-induced cytokine production, human DPCs were pre-treated with p38 inhibitors (SB203580 and SB212190), ERK inhibitors (PD90859 and ERK inhibitor II) or JNK inhibitor (SP600125 and JNK inhibitor II), respectively. As a result, poly(I:C)-induced IL-8 production was substantially decreased by p38, ERK or JNK inhibitors in a dose dependent-manner, suggesting that poly(I:C)-induced IL-8 production is mediated by MAP kinase signaling pathway. Indeed, C/EBPβ and NF-κB are involved in poly(I:C)-induced IL-8 expression in human DPCs. Furthermore, synergistic effect of poly(I:C) and bacterial components or metabolites were tested considering that subsequencial invasion of viruses or bacteria can worse the periodontal disease symptoms. A synthetic lipopeptide Pam2CSK4 mimicking bacterial lipoproteins showed synergistic effect with poly(I:C) in IL-8 production in human DPCs. In contrast, short chain fatty acids (SCFAs) such as butyrate, propionate and acetate, produced by microbiota metabolism, potently suppressed poly(I:C)-induced IL-8 secretion in order.

Conclusions Collectively, the current study demonstrated that TLR3 is the most highly expressed on human DPCs among TLRs 1-10 and poly(I:C) is a potent immune stimulator which activates TLR3 signaling pathway. In addition, TLR2 ligand, such as Pam2CSK4, potentiates poly(I:C)-induced inflammatory responses in human DPCs. On the other hand, SCFAs, microbial metabolites, down-regulate poly(I:C)-induced chemokine production. This study will provide new insight of innate immune responses by viral infection and viral-bacterial interactions in pulpal microenvironment.

1. 목적 치수강에 존재하는 치수세포(dental pulp cell)는 중간엽줄기세포의 특성이 있으며 상아아세포, 지방세포, 연골세포, 조골세포, 신경세포 등으로 분화할 수 있다. 치수세포는 치아우식증, 치아 손상, 상아세관을 통해 구강 내 미생물에 노출될 수 있고 미생물-연관 분자 패턴(microbe-associated molecular pattern)에 의한 염증반응이 일어나 치수염으로 이어질 수 있다. 이때 IL-1, IL-6, IL-8, TNF-α, MMP-9을 포함한 염증 매개물이 치수염을 악화시킬 수 있다. 구강에는 다양한 미생물이 존재하고 이들은 여러 감염성 구강 질환과 밀접한 연관이 있다. 치수 조직이 구강내 미생물에 노출되었을 때 몇몇의 구강 바이러스는 치수세포의 면역반응을 유도할 수 있다. 그러나 치수세포와 미생물과의 상호작용 및 이에 대한 면역학적 특성에 대한 연구는 부족한 실정이다. 치수세포는 감염 및 손상 후 치수재생에 중요한 역할을 하기 때문에 병인 기전 연구 및 치료제 개발을 위해선 치수세포의 면역학적 특성에 관한 연구가 필요하다. 이와 같은 연구를 통해 미생물 유래 인자와 치수세포의 상호작용을 분자적 수준에서의 이해를 돕고 병인 기전의 심층적인 이해를 도울 수 있다. 따라서 본 연구에서는 구강 내 바이러스 및 세균에 의한 구강질환 예방 및 치료방법 개발에 중요한 기초지식을 제공하고자 한다.

2. 방법 사람치수세포를 이용한 실험은 서울대학교 치의학대학원 연구윤리심의위원회의 승인을 받아 수행하였다(S-C20200023). 사람치수에서 치수세포를 분리하여 일차 배양 하였다. 치수세포의 미생물 유래 물질을 인지할 수 있는 수용체의 발현 양상을 확인하기 위해 real-time RT-PCR 방법을 이용하여 Toll 유사 수용체의 mRNA 발현 수준을 확인하였다. Poly(I:C) 처리 시 치수세포에서 분비되는 염증반응에 관여하는 싸이토카인 및 케모카인의 발현 양상을 확인하기 위해 real-time RT-PCR을 이용하여 IL-8, CXCL10, CCL2, CCL5, CCL20, IFN-β, IL1-β, IL-6, TNF-α 의 mRNA 발현을 확인하였고, ELISA를 이용하여 IL-8, CXCL10, CCL2, IL-1β, IL-6, TNF-α를 단백질 수준에서 확인하였다. 또한, TLR3 siRNA를 transfection한 뒤 poly(I:C)를 처리하여 IL-8 발현에 차이가 생기는지 real-time RT-PCR, ELISA를 이용하여 mRNA 및 단백질 수준에서 확인하였다. 신호전달경로를 확인하기 위해 MAP kinase 억제제를 농도별로 전 처리 후 poly(I:C)를 처리하고 ELISA로 IL-8 분비에 차이가 있는지 확인하였다. 인간 IL-8 유전자 프로모터의 전사 조절 인사 결합부위에 돌연변이를 가진 리포터 유전자를 transfection 한 뒤 luciferase assay를 하여 poly(I:C) 처리 시 유도되는 IL-8 분비에 주요한 영향을 미치는 전사 조절 인자를 분석하였다.

3. 결과 사람치수세포에서 미생물 유래 물질을 인지할 수 있는 수용체의 발현을 확인하기 위해 Toll 유사 수용체들(TLRs)의 mRNA 발현 수준을 비교하였을 때 TLR3의 발현량이 상대적으로 가장 높고 TLR6, TLR5, TLR1 또한 비교적 높게 발현하고 있음을 확인하였다. 이에 따라, TLR3의 리간드이자 바이러스에서 유래하는 dsRNA의 모사물질인 poly(I:C)를 처리하였을 때 IL-8의 mRNA 및 단백질 수준에서 모두 발현이 유의하게 증가하였다. 또한, 이는 poly(I:C)의 농도 및 처리시간에 의존적으로 증가하였다. Poly(I:C)에 대한 치수세포의 면역학적 특성을 확인하기 위해 여러 싸이토카인과 케모카인의 발현을 확인해 보았을 때, poly(I:C)에 의해 IL-8 뿐만 아니라 CXCL10, CCL2, CCL5, CCL20, IFN-β, IL-6의 발현도 유의하게 증가하였다. 다만, 치수세포에서 염증성 싸이토카인인 IL-1β, TNF-α는 분비되지 않았다. 치수세포가 poly(I:C)를 인지하는 것이 TLR3 의존적인지 확인하기 위해 TLR3 siRNA를 transfection 하였다. 치수세포에서 TLR3가 knock down 되었을 때는 대조군과 비교해 poly(I:C)에 대한 IL-8 생성이 유의하게 감소하였다. 그리고 세포질에 존재하는 dsRNA 수용체인 MDA5와 RIG-1의 mRNA 발현이 증가함을 확인하였다. 신호전달경로 확인을 위해 p38 억제제(SB203580, SB202190), ERK 억제제(PD90859, ERK inhibitor II), JNK 억제제를 전처리 하였을 때, 전처리한 억제제의 농도에 의존적으로 poly(I:C)에 의한 IL-8 생성이 감소하는 것을 통해 MAP kinase signaling pathway가 관여함을 확인하였다. 또한, 인간 IL-8 프로모터의 전사인자 결합부위(AP-1, NF-κB, C/EBPΒ)에 돌연변이를 가진 리포터 유전자를 transfection 하여 luciferase reporter gene assay 한 결과, NF-κB, C/EBPΒ가 poly(I:C)에 의한 IL-8 발현에 주요한 전사인자임을 확인하였다. 바이러스와 박테리아의 상호작용이 구강질환에 영향을 미칠 수 있다는 것을 고려하여 poly(I:C)와 박테리아 유래 물질을 병용처리하여 면역반응에 어떠한 영향을 미치는지 확인하고자 하였다. 그 결과 poly(I:C) 와 lipopeptide가 poly(I:C)에 의한 IL-8 발현에 상승효과 있음을 확인하였다. 구강 및 소화관의 상주균이 식이섬유를 발효하여 대사물질로 단쇄지방산인 acetate, propionate, butyrate가 생성되는데, 이러한 미생물 유래 물질을 poly(I:C)와 병용처리 하였을 때 IL-8의 발현을 감소시키는 효과가 있음을 확인하였다.

4. 결론 위의 결과들을 종합하여 보면, 치수세포는 dsRNA를 인지할 수 있는 TLR3를 높은 수준으로 발현하고 있어 구강 내 바이러스에 대한 강한 면역반응을 유도할 수 있음을 시사한다. 치수세포는 poly(I:C)에 대한 반응으로 IL-8을 비롯하여 IL-6, IFN-β, CCL2, CXCL10, CCL5, CCL20을 분비함으로써 바이러스에 대한 면역반응을 개시한다. 치수세포에서 poly(I:C)에 의한 이러한 면역반응은 TLR3를 통해 인지되어 MAP kinase signaling pathway를 경유하고 NF-κB, C/EBPβ 전사인자를 활성화시킴으로써 일어난다. 더불어 상주균이 대사물질로 분비하는 단쇄지방산인 acetate, propionate, butyrate가 poly(I:C)에 의한 싸이토카인 분비를 완화하여 면역반응을 조절할 수 있다.