Development of Colorimetric HTS Method for Protein Engineering of Lysine Decarboxylase

Abstract

화석 연료 자원 고갈 문제가 거론되기 시작한 이후부터 화석 연료 자원을 대체할 수 있는 생물 기반의 생분해성 재료를 찾는 것은 중요한 문제로 대두되어왔다. 최근 지속 가능한 개발의 일환으로 효소 반응 체계를 이용하여 합성 고분자를 생산하는데 중요한 전구 재료가 되는 기능성 단량체를 합성하는 연구들이 활발히 이루어지고 있다. 특히 현재 알려진 아미노산 탈탄산 효소 중 라이신 탈탄산 효소를 이용하여 폴리아마이드 합성에 있어서 기능성 단량체 역할을 하는 카다베린을 합성하는 공정을 개발하려는 많은 노력들이 보고되고 있다. 본 연구에서는 색깔 변화를 통한 라이신 탈탄산 효소의 고속 대량 스크리닝 기법을 확립하려는 시도가 선행하였다. 그 후 포화 돌연변이 기법을 이용한 단백질 공학 기법으로 대장균 유래의 라이신 탈탄산 효소를 개량하고 이렇게 생성된 돌연변이 된 라이신 탈탄산 효소들을 앞서 확립된 색깔 변화를 통한 라이신 탈탄산 효소의 고속 대량 스크리닝 기법을 이용해 야생형 라이신 탈탄산 효소 활성 보다 더 높은 활성을 보이는 돌연변이 라이신 탈탄산 효소를 탐색하였다. 라이신 탈탄산 효소의 산업적 활용 방안의 일환으로 라이신 탈탄산 효소의 고정화에 대한 연구도 진행되었다. 첫째, 색깔 변화를 이용한 라이신 탈탄산 효소에 대한 고속 대량 스크리닝 기법은 대장균 유래의 라이신 탈탄산 효소가 다른 아민기 전이 효소와 같은 PLP를 보조인자로 사용하는 효소이며 그 반응 기작 상에서 수소이온이 중간 반응에 참여해야 탈탄산 반응이 일어난다는 점에 착안하여 pH 지시약인 BTB를 이용해 확립되었다. 이 라이신 탈탄산 효소에 대한 고속 대량 스크리닝 기법은 두 단계로 이루어지며, 콜로니 레플리카를 이용한 첫 번째 단계의 스크리닝 과정을 통해 매우 많은 수의 돌연변이체들로부터 활성이 증가되었을 확률이 높은 돌연변이체들을 추려 그 후보군의 크기를 현저히 줄일 수 있었다. 이어진 두 번째 단계의 스크리닝 과정에서 첫 번쨰 스크리닝 과정을 통과한 돌연변이체들과 야생형 라이신 탈탄산 효소의 반응 초기 속도 차이를 96 well plate 상에서 비교 관찰할 수 있었다. 라이신 탈탄산 효소의 개량 방법으로 단백질공학의 한 종류인 포화 돌연변이 기법이 사용되었다. 포화 돌연변이 기법을 실시하기에 앞서 라이신 탈탄산 효소의 3차원 구조 분석과 단백질 서열 상동 비교 분석을 바탕으로 선정된 23개의 잔기들을 각각 알라닌으로 치환하여 그 활성 변화를 살펴보았다. 그 결과를 바탕으로 포화 돌연변이 기법을 사용할 후보 잔기들을 선정하였다. 결과적으로 앞서 확립되었던 색깔 변화를 이용한 라이신 탈탄산 효소에 대한 고속 대량 스크리닝 기법을 이용하여 276번 위치의 프롤린이 류신으로 치환된 돌연변이체를 찾아낼 수 있었다. P276L 돌연변이체의 경우 그 고유활성도가 108 U/mg으로 야생형 라이신 탈탄산 효소의 고유활성도인 44 U/mg 보다 2.5배 높은 고유활성도를 관찰할 수 있었다. 활성을 높이기 위한 효소 개량 연구와 더불어 티로시나아제 처리를 한 젤라틴 비드를 이용한P276L 돌연변이체의 고정화에 대한 연구도 같이 진행되었다. 라이신 탈탄산 효소가 고정화 된 티로시나아제 처리를 한 젤라틴 비드가 충진된 컬럼을 사용하여 4 차례에 걸친 라이신 탈탄산 효소 반응이 실행되었고, 그 결과를 통해 고정화된 효소의 활성이 1달 이상 유지되는 것을 확인하였다. 또한 4차례에 걸친 라이신 탈탄산 효소 반응에서 동일한 컬럼을 사용하여 고정화 된 라이신 탈탄산 효소의 재사용성을 검증할 수 있었다.

It has been an important issue to find an alternative bio-based and biodegradable material since the exhaustion of fossil fuels has been intensified. Recently many of researches have been studied about the synthesis of functional monomer as a precursor for synthetic polymers using enzymatic system as a part of sustainable development. Especially many efforts to develop the process of synthesizing cadaverine, a functional monomer for poly-amide, by lysine decarboxylase are being reported continuously. In this work, we studied about a colorimetric high-throughput screening (HTP screening) method for mutants of lysine decarboxylase(LDC) that may perform better than its wild type, protein engineering, specifically, saturation mutagenesis and immobilization of the enzyme for industrial application of LDC. The colorimetric HTP screening method using bromothymol blue as a pH indicator was set-up based on the proton consumption during the reaction of PLP-dependent LDC originated from E. coli. It consists of the 1st screening and the 2nd screening. Through the 1st screening method using colony replica, the large size of the library could be downsized significantly. We could observe the difference in initial rate between wild type LDC and the mutants which passed the 1st screening step on 96-well plate by 2nd screening method. It was decided to carry out a site-saturation mutagenesis for protein engineering of LDC. 23 sites for alanine scanning were determined based on 3D structure analysis and sequence homology comparison. The candidates for site-saturation mutagenesis were selected according to the result of the alanine scanning. Finally P276L LDC mutant was screened by the colorimetric HTP screening method set-up in this study. We could observe that P276L LDC mutant showed two and a half times higher specific activity, 108 U/mg, than the specific activity of wild type LDC. Immobilization of the P276L mutant was tried with tyrosinase-treated gelatin bead. Through the four times of LDC reactions with the tyrosinase- treated LDC-gelatin beads, it came out that the activity of immobilized enzyme was maintained for one month and it is reusable.