Role of Translation Initiation Factor-2S2 and Transducer of ErbB2.1 in Carcinogenesis:Smad4 as a Molecular Target

Abstract

The activation of oncogenes and inactivation of tumor suppressor genes are the well known hallmarks of cancer. A wide array of cross regulation between oncogenes and tumor suppressor genes has been implicated in tumor development and progression. Although the tumor suppressor function of mothers against decapentaplegic homolog-4 (Smad4) has been widely investigated and diverse classes of Smad4 interacting proteins have been identified, the hunt for new Smad4 interacting and/or regulatory proteins remains a challenge. According to our protein microarray database, Smad4 can bind with two important cellular components, the eukaryotic translation initiation factor-2S2 (eIF2S2, alternatively known as eIF2) and the transducer of ErbB2.1 (Tob1). While eIF2S2 has been reported to be overexpressed in certain cancers, the expression of Tob1 is lost in many cancers. In the present study, we sought to examine the role of eIF2S2 in human cervical carcinogenesis and that of Tob1 in human gastric cancer, and to elucidate their possible effects on the modulation of Smad4 function. We first attempted to unravel the role of eIF2S2 in cervical carcinogenesis. Immunohistochemical analysis of human cervical carcinoma tissues revealed that the expression of eIF2S2 was gradually increased in a stage-specific manner. As compared to normal epithelial cells of different tissue origin, the expression of eIF2S2 was elevated in epithelial cancer cells of breast, ovary and cervix. To examine if eIF2S2 plays a critical role in cervical carcinogenesis, we stably transfected human cervical cancer (SiHa) cells with short-hairpin RNA (shRNA) targeting eIF2S2. The anchorage-independent colony formation and in vivo tumor growth were significantly decreased in eIF2S2-shRNA- transfected cells in comparison to cells transfected with control-shRNA. Moreover, phorbol ester-induced soft agar colony formation was significantly increased in NIH3T3 cells stably transfected with p3xFlag-CMV10-eIF2S2 as compared to cells harboring empty vector. In addition, the si-RNA-based knockdown of eIF2S2 reduced the proliferation and migration of cervical cancer cells, which was associated with decreased expression and the activity of matrix metalloproteinase-9. These findings indicate that eIF2S2 may be involved in the development and progression of cervical cancer. We next verified our protein microarray finding of interaction between eIF2S2 and Smad4 by immunoprecipitation assay. The interaction between eIF2S2 and Smad4 was further confirmed by bimolecular fluorescence complementation (BiFC) assay by co-transfecting HeLa cells with plasmids harboring truncated domains of eIF2S2 and plasmid containing full length Smad4. We found that eIF2S2 interacted with Smad4 through its N-terminal domain. Furthermore, BiFC analysis of HeLa cells co-transfected with plasmids harboring N-terminus of eIF2S2 and different deletion constructs of Smad4 revealed that the N-terminus of eIF2S2 interacted with the MH-1 domain of Smad4. We also studied the role of eIF2S2 in modulating Smad4 function. Whereas transient overexpression of eIF2S2 diminished the expression of Smad4, knockdown of eIF2S2 elevated Smad4 expression in cervical cancer cells. However, overexpression or knockdown of eIF2S2 did not alter the mRNA expression of Smad4, suggesting the possibility of post- translational regulation of Smad4 expression by eIF2S2. Since Smad7, an inhibitory Smad that functions as a scaffold for recruiting E3-ubiquitin ligase enzymes is involved in Smad4 degradation, we examined the potential of eIF2S2 in interacting with Smad7 and the modulation of Smad7 upon overexpression or knockdown of eIF2S2 in SiHa cells. While ectopically expressed of eIF2S2 interacted with Smad7 and elevated the expression of Smad7, knockdown of eIF2S2 diminished the expression of Smad7. We also found that overexpression of eIF2S2 attenuated the expression of p15 and p27and the promoter activity of p15, which are the target genes of Smad4. Thus, our study demonstrates the pro-tumorigenic role of eIF2S2, which diminished the expression and function of a tumor suppressor protein Smad4, in cervical cancer cells. Transducer of ErbB-2.1 (Tob1), a tumor suppressor protein, is inactivated in a variety of cancers including stomach cancer. However, the role of Tob1 in gastric carcinogenesis remains elusive. The present study was aimed to investigate if Tob1 could inhibit gastric cancer progression, and to elucidate its underlying molecular mechanisms. We found differential expression of Tob1 in human gastric cancer (MKN28, AGS, and MKN1) cells. The over-expression of Tob1 induced apoptosis in MKN28 and AGS cells, which was associated with sub-G1 arrest, activation of caspase-3, induction of Bax, inhibition of Bcl-2, and cleavage of polyadiporibosyl polymerase (PARP). In addition, Tob1 inhibited the proliferation, migration, and invasion, which were reversed in MKN1 and AGS cells transfected with Tob1 si-RNA. Furthermore, over-expression of Tob1 in MKN28 and AGS cells increased the expression of Smad4, leading to the elevated expression and the promoter activity of p15, which was diminished by silencing Tob1 using specific si-RNA. Tob1 decreased the phosphorylation of Akt and glycogen synthase kinase-3 (GSK3) in MKN28 and AGS cells, thereby resulting in the reduced protein expression and the transcriptional activity of -catenin, which in turn decreased the expression of cyclin D1, cyclin-dependent kinase-4 (CDK4), urokinase plasminogen activator receptor (uPAR), and peroxisome proliferator and activator receptor- (PPAR). Conversely, silencing of Tob1 induced the phosphorylation of Akt and GSK-3, and increased the expression of -catenin and its target genes. Taken together, our study demonstrates that the overexpression of Tob1 inhibits gastric cancer progression by activating Smad4- and inhibiting -catenin-mediated signaling pathways. Taken together, the present study demonstrates the negative and positive regulation of Smad4 function by eIF2S2 and Tob1, respectively, which partly explains the mechanisms underlying the pro-tumorigenic role of eIF2S2 in cervical cancer and tumor suppressor function of Tob1 in gastric carcinogenesis.

발암유전자의 활성화와 종양억제유전자의 불활성화는 암의 잘 알려진 특징이며, 발암유전자와 종양억제유전자의 수 많은 상호 조절작용은 암의 발달, 진행과 연관이 있다. Mothers against decapentaplegic homolg-4 (Smad4)의 암 억제 기능은 다방면으로 연구되었으며 Smad4와 상호작용하는 다양한 종류의 단백질들이 이미 알려져 있지만, Smad4와 상호작용하거나 또는 Smad4를 조절하는 새로운 단백질을 찾아내는 것은 중요한 과제로 남아있다. 우리 연구실의 기존 Bacculovirus protoarray database에 따르면 Smad4는 두 개의 중요한 세포 내 성분과 결합할 수 있다. 하나는 eukaryotic translation initiation factor 2S2 (eIF2S2, eIF2)이며, 다른 하나는 transducer of ErbB2.1 (Tob1)이다. eIF2S2는 몇몇 암에서 과발현되는 것으로 알려져 있으며, 반대로 Tob1의 발현은 여러 암에서 억제되어있다. 이번 연구에서 우리는 인간 자궁경부암의 발암기전에서 eIF2S2의 역할과 인간 위암에서 Tob1의 역할을 확인하고, 이들이 Smad4의 조절에 미칠 수 있는 영향에 대해 알아보았다. 우리는 먼저 자궁경부암 발암기전에서 eIF2S2의 역할을 확인해보았다. 인간 자궁경부암조직의 면역조직화학적 분석을 통해 eIF2S2의 발현이 암의 단계에 따라 증가함을 알 수 있었다. 또한 다른 조직 유래의 정상 상피세포와 비교해보았을 때 eIF2S2의 발현은 유방암, 난소암, 자궁경부암에서 증가되어 있었다. eIF2S2가 자궁경부암 발암기전에서 중요한 역할을 하는지 확인해보기 위해 인간 자궁경부암 세포주인 SiHa에서 eIF2S2의 발현을 감소시키는 short hairpin RNA (shRNA)를 형질주입하여 stable cell line을 구축하였다. 구축한 stable cell line으로 실험한 결과 Control-shRNA 형질주입세포에 비해 eIF2S2-shRNA 형질주입세포에서 anchorage-independent colony formation가 확연히 감소하는 것으로 나타났다. 반대로 p3xFlag-CMV10-eIF2S2로 구축한 NIH3T3 stable cell line의 경우 empty vector에 비해 phorbol ester-induced soft agar colony formation가 눈에 띄게 증가하였다. 또한 자궁경부암 세포주인 SiHa와 HeLa 세포에서 siRNA를 이용해 eIF2S2의 발현을 감소시켰을 때 proliferation과 migration이 감소하였으며, 이는 matrix metalloproteinase-9의 활성 감소와 관련이 있는 것으로 확인되었다. 위의 결과들을 통해 eIF2S2가 자궁경부암의 발달, 진행과 연관이 있음을 알 수 있었다. 다음으로 우리의 protein microarray 실험에서 상호작용을 하는 것으로 확인되었던 eIF2S2와 Smad4가 실제로 상호작용을 하는 것인지 확인해보기 위해 SiHa 세포의 용해물을 이용하여 immunoprecipitation assay를 시행하였다. 또한 HeLa 세포에 온전한 Smad4 plasmid와 불완전한 eIF2S2 domain을 가진 plasmid를 동시에 형질주입한 뒤 bimolecular fluorescence complementation (BiFC) assay로 eIF2S2와 Smad4가 내생적 상호작용을 한다는 것을 추가로 확인할 수 있었으며, eIF2S2의 N-말단 domain을 통해 Smad4와 상호작용한다는 것도 확인하였다. eIF2S2의 N-말단과 Smad4를 여러 형태로 결실시킨 plasmid를 이용해 HeLa 세포에서 추가적인 BiFC 분석을 한 결과 eIF2S2의 N-말단과 Smad4의 MH-1 또는 MH-1 linker domain이 상호작용함을 알 수 있었다. 이에 더하여 eIF2S2가 Smad4의 기능을 조절하는지에 대해 알아보았다. eIF2S2의 일시적 과발현은 Smad4의 발현을 저해시키는 반면, eIF2S2의 knockdown은 자궁경부암 세포의 Smad4 발현을 증가시켰다. 그렇지만 eIF2S2를 과발현 또는 억제 시켰을 때 Smad4의 mRNA 발현 변화는 나타나지 않는 것으로 보아 eIF2S2가 Smad4의 발현을 전사후 과정 또는 번역 과정에서 조절하는 것으로 생각되었다. 억제적 Smad인 Smad7는 E3- ubiquitin연결효소들을 끌어 모아 Smad4를 분해시키기는 것으로 알려져 있으므로 우리는 SiHa 세포에서 eIF2S2를 과발현 또는 억제시킨 뒤 eIF2S2와 Smad7의 상호작용 여부를 확인해보았다. eIF2S2의 과발현은 Smad7과의 상호작용을 일으키고 Smad7의 발현을 증가시키는 반면, eIF2S2를 억제시켰을 때에는 Smad7의 발현이 감소하였다. 또한 eIF2S2의 과발현이 Smad4의 표적 유전자인 p15, p27의 promoter 활성과 발현을 감소시키는 것을 확인하였다. 결론적으로 이번 연구결과는 eIF2S2가 종양억제단백질인 Smad4의 발현과 기능을 감소시킴으로써 자궁경부암 발암기전에 있어서 전-발암적인 역할을 한다는 것을 보여주었다. 종양 억제 단백질인 Transducer of ErbB-2 (Tob1)은 위암을 포함한 다양한 암에서 불활성화 되어있다. 그렇지만 위암의 발암기전에서 Tob1의 역할은 잘 알려지지 않았다. 이번 연구의 목적은 Tob1이 in vitro상에서 위암의 진행을 저해할 수 있음을 확인하는 것이며, 그 분자적 기전을 설명하는 것이다. 우리는 인간 위암 세포(MKN28, AGS, MKN1)에서 Tob1의 발현이 다양하게 나타나는 것을 발견하였다. MKN28과 AGS에서 Tob1을 과발현시켰을 때 apoptosis가 증가하였으며, 이는 sub- G1 억제, caspase-3의 활성화, Bax의 유도, Bcl-2 억제, polyadiporibosyl polymerase (PARP)의 분해와 관련이 있었다. 게다가 MKN1과 AGS 세포에서 Tob1은 Cell proliferation, Cell migration, Cell invasion을 억제하였으며, Tob-1 siRNA를 형질주입한 세포에서는 반대로 Cell proliferation, Cell migration, Cell invasion이 증가하는 것으로 나타났다. 또한 MKN28과 AGS 세포에서 Tob1의 과발현은 Smad4의 발현을 증가시키고, 이로 인해 p15의 promoter 활성과 발현이 증가하였다. 마찬가지로 Tob1 siRNA를 이용한 실험에서는 반대로 활성과 발현이 감소하는 것으로 나타났다. Tob1은 MKN28과 AGS 세포에서 Akt와 glycogen synthase kinase-3 (GSK3)의 인산화를 감소시키고, 이로 인해 -catenin의 전사 활성과 단백질 발현이 감소하게 되며, 이어서 cyclin D1, cyclin-dependent kinase- 4(CDK4), urokinase plasminogen activator receptor (uPAR), peroxisome proliferator and activator receptor- (PPAR)의 발현도 감소하는 것으로 나타났다. 반대로 Tob1을 억제시켰을 때에는 Akt와 GSK-3의 인산화가 증가하고 -catenin과 그 표적 유전자들의 발현도 증가하였다. 이러한 결과들로부터 Tob1의 과발현이 Smad4를 활성화시키고, -catenin관련 signaling pathways를 억제함으로써 위암의 진행을 저해할 수 있음을 확인하였다. 이번 연구를 통해 우리는 Smad4의 기능이 eIF2S2 또는 Tob1에 의해 음성적 또는 양성적으로 조절을 받을 수 있음을 알 수 있었으며, 자궁경부암에서는 eIF2S2의 전-발암적 기능, 위암에서는 Tob1의 종양억제적 기능의 기전을 각각 확인할 수 있었다.