Anoctamin chloride channel isoforms in mouse submandibular salivary gland: alternative splicing and protein expression

Abstract

외분비 상피 세포의 내강쪽 세포막에 위치한 칼슘-활성화 염소 채널은 분비에 매우 중요한 역할을 한다. 최근, 세포막 단백질인 아녹타민 1이 칼슘-활성화 염소 채널 기능과 밀접한 관계가 있음이 보고되었다. 아녹타민 1은 비슷한 구조를 가진 열 개의 아형을 포함하는 유전자군 중 한 구성원이다. 그러나 아녹타민 1과 유사하게 칼슘-활성화 염소 채널로 알려진 아녹타민 2를 제외하면, 다른 아녹타민 구성원들의 분자적 특성과 기능은 아직까지 명확하지 않다. 본 연구에서는 생쥐의 타액선에서 아녹타민 유전자군의 발현을 확인하고 그 특성을 규명하고자 한다. 특히, 아녹타민 splice-variant의 존재를 확인하는 동시에 생쥐의 타액선에서 주로 발현되는 아녹타민 단백질의 세포상 위치와 oligomeric interaction을 연구하고자 한다. 이를 위하여, 먼저 RT-PCR을 통해 생쥐의 타액선에서 발현하는 아녹타민 구성원을 가려내고 pcDNA3.1(+) 발현 벡터에 클로닝하여 전체 서열을 분석함으로써 아녹타민 구성원임을 확인하였다. 전체 서열을 증폭 길이 1kb 이하가 되도록 나누어 PCR하여 해당 부위에서의 splice site 존재를 조사하였다. 생쥐의 타액선에서 발현되는 아녹타민 구성원 및 splice-variant 단백질의 세포상 위치를 보기 위하여, 각 클론을 형광 단백질로 표지하여 HEK293 상피 세포에 transfection하고 공초점 현미경으로 세포상 위치를 확인하였다. 또한 oligomeric interaction을 확인하기 위하여 공초점 현미경을 사용, FRET(Föster resonance energy transfer) 실험을 수행하였다. 생쥐의 타액선에서는 아녹타민 1과 6, 10이 강하게 발현하였으며 아녹타민 5가 그 다음으로 많았고, 아녹타민 3과 4, 9가 약하게 발현하였다. 생쥐의 타액선에서 아녹타민 1, 5, 6의 splice-variant를 검사한 결과 아녹타민 5와 6에서 알려지지 않은 splice site들이 매우 다양하게 나타나는 것을 볼 수 있었다. 아녹타민 1, 5, 6과 splice-variant들을 형광 단백질로 표지하여 세포상 위치를 확인한 결과, 아녹타민 1과 6의 전체 서열 단백질은 세포막에 위치하는 반면에 아녹타민 6의 splice-variant와 아녹타민 5의 전체 서열 단백질을 포함하는 모든 splice-variant는 세포내에 존재하였다. FRET 실험을 통하여 세포막에서 아녹타민 1과 6가 상호 작용이 가능할 정도로 매우 가까운 위치에 있는 것을 볼 수 있었다. 이러한 결과를 통하여, 생쥐의 타액선에서 발현되는 아녹타민 5와 6의 분자적 특성은 이제까지 알려진 것보다 훨씬 다양하며, 특히 아녹타민 6의 splice-variant들에서 결실된 부위가 아녹타민의 세포막 수송에 관련되어 있다는 것을 알 수 있다. 또한 아녹타민 1과 6가 같은 세포에서 발현할 경우 서로 상호 작용할 가능성을 확인하였다.

The main goal of this study is to identify and characterize Anoctamin family of Ca2+-activated chloride channels in mouse submandibular salivary gland. The presence of Anoctamin splice-variants expressed in mouse submandibular gland as well as the cellular localizations and oligomeric interactions of Anoctamin protein were investigated. To identify the expressed members of the Anoctamin family in mouse salivary gland, total RNA from adult mouse submandibular salivary gland was isolated and RT-PCR analysis using specific oligonucleotides was performed to define the expression of all ten isoforms (Anoctamin 1-10) and their splice-variants. Multiple splice-variants of Anoctamin 5 and 6 were detected. Many of these were novel. It is known that Anoctamin 1 exists as a homodimer on the plasma membrane, but subcellular localization and protein interactions with other Anoctamins have not been characterized. Epitope-tagged forms of each Anoctamin 1, 5, 6 clones with eGFP and/or mCherry were analyzed. Anoctamin 1 and 6 were localized on the plasma membrane in HEK293 cells by confocal imaging. Föster resonance energy transfer (FRET)- based experiments showed that Anoctamin 1 and 6 were localized in close proximity for direct interaction. All Anoctamin 5 isoforms including full-length and Anoctamin 6 alternative spliced isoforms were localized intracellularly when expressed in HEK293 cells.