Microfluidic in vitro model of 3D Tumor Vascular Networks for Cancer Immunotherapy Screening

Abstract

Colorectal cancer is second most common cause of cancer death. Nemours approaches for the treatment of colorectal cancer have been proposed while there is still absence of breakthrough therapy designation. Cancer immunotherapy holds great promise recently, however, the exact mechanism of the interaction between immune cells and tumor cells remains poorly understood. Moreover, it is important to consider blood vessel in colorectal cancer study since the blood flows from colon to liver causing distant metastasis. Despite the importance of blood vessel in tumor microenvironment, current models have missed the tumor vascular networks. This thesis describes an injection molded platform to mimic the complex three-dimensional tumor vascular networks for evaluating immune cell behavior in tumor microenvironment(TME). Our platform consisting of 28 wells enabled simple and high-throughput screening. We characterized the aberrant tumor vasculature according to colorectal cancer subtypes and confirmed an increased permeability of blood vessels, which is a major feature of aberrant tumor vasculature. We also evaluated natural killer (NK) cell infiltration and cytotoxicity according to CMS subtypes. NK cells showed higher cytotoxicity in CMS 1 type colorectal cancer compared to the others and this result is correspondence with physiological theory of existence of intratumoral immune cells. In the meantime, the subtype classification of macrophages and the role of each subtype in various carcinomas including colorectal cancer have been studied for decades. However, consistent results on the role of tumor associated macrophages and their relationship with clinical prognosis have not been defined yet. In this thesis, we verified the effect of macrophage on not only tumor but also tumor microenvironment according to their subtypes. We confirmed M1 macrophage inhibit the tumor progression whereas M2 macrophage enhance. Our results showed physiological relevance of our platform and potential of our platform in both chemotherapy and immunotherapy since perusable vascular networks provided a route for the delivery of lymphocytes or molecules from a distance site to the tumor site. We hope our in vitro tumor vascular networks model to be used for better understanding of cancer and cancer treatment

대장암은 전체 사망률 2위에 해당하는 중대한 질병이다. 특히 대장암은 간으로 직접적으로 이어지는 혈관인 간문맥(Portal vein)을 따라 가장 빈번하게 전이가 일어나는 질병이기 때문에 대장암의 연구에 있어 주변 혈관에 관한 연구는 더욱 중요성이 크다. 하지만 현재까지 암-혈관에 관련된 연구는 이종이식을 통한 연구에 많이 치우쳐 있다. 이종이식을 통한 연구는 짧게는 수 주에서 수 개월이 걸리고 그 시간과 비용이 막대하다. 뿐만 아니라 사람과 동물이라는 이종간의 계통발생학적 차이라는 한계가 있다. 이를 극복하기 위하여 마이크로 공학을 이용한 다양한 체외 모델들이 제시되고 있으나, 여전히 낮은 효율과 실험자의 높은 숙련도를 요구한다. 이에 본 연구는 플라스틱 사출 성형 기반 디바이스를 이용하여 고효율 암 혈관 미세환경을 구현하고자 하였다. 레일 가이드 고속 유체 패터닝 기술을 이용하여 누구나 쉽게 3차원 세포 배양을 가능하도록 하였으며, 적은 양의 세포와 배양액만으로도 5일 이내에 관류 가능한 암-혈관 공배양 시스템을 구현할 수 있는 최적의 조건을 확립하였다. 또한 정상혈관 대비 암혈관의 두드러진 특성에 대하여 형태적 기능적인 검증을 통해 유효성을 확인하였으며, 그 결과 암혈관은 정상혈관 대비 혈관의 투과성이 현저히 높아지는 것을 보였다. 이에 면역세포의 일종인 자연살해세포를 이용하여 면역세포의 혈관을 통한 면역감시체계를 구현해냈으며, 장기간 라이브 이미징 기술을 이용하여 자연살해세포의 혈관밖유출 및 유입 그리고 대장암의 암종별 세포독성에 대한 평가를 수행하였다. 자연살해세포는 대장암 암종별에 따라 서로 다른 혈관 밖 유입률 및 세포독성을 보였으며 이는 임상적으로 유의미한 결과라고 볼 수 있다. 뿐만 아니라 림프구의 일종인 대식세포를 이용하여, 대식세포의 분화에 따른 암-혈관 미세환경에 미치는 영향에 대한 평가를 수행하였다. 그 결과 대식세포는 분화에 따른 아형에 따라 암세포의 자살을 유도하거나 반대로 암세포의 진행을 유도하기도 하는 서로 다른 특성을 갖는 것 뿐만아니라 혈관의 투과성 및 주변 세포외기질의 변화에도 영향을 미치는 것을 체외에서 확인하였다. 대식세포는 전체 림프구를 구성하는 면역세포 중 85퍼센트를 차지하는 세포로 자연살해세포와 더불어 차세대 면역세포치료제로서의 가능성이 매우 높다. 본 연구를 통해 개발된 모델은 관류가능한 암-혈관 시스템을 통하여 매년 새롭게 개발되는 항암 신약 뿐만아니라 면역세포치료제의 평가 플랫폼으로써 무한한 활용 가능성을 지닌다고 볼 수 있다.