Electrokinetic DNA Extraction Method Using a Nanofilter for Molecular Diagnosis of Pathogens

Abstract

This dissertation covers the entire process of molecular diagnosis of waterborne pathogens from nucleic acid extraction (sample pretreatment) to a solid-state nanopore platform that detects nucleic acids at single molecule level. the current issues of solid-state nanopore were discussed, and analyzing method is introduced through an electrochemical approach when DNA passes through the nanopore. Specifically, sensitivity improvement is discussed which is one of the most important technical issues in nanopore research, including temporal resolution and signal to noise ratio (SNR) improvement. Previous research results on this technical issue are summarized in this dissertation, and based on these studies, a solid-state nanopore device with improved sensitivity using an insulating substrate and Polydimethylsiloxane (PDMS) microchannel is covered. Based on the basic concept that negatively charged nucleic acids are transferred by an electric field, a single nanopore has been expanded into a multiple nanopore structure and attempts to use it as a separator for nucleic acid extraction during sample preparation were also introduced in this dissertation. The device was named nanofilter chip. Important factors for DNA extraction performance evaluation are discussed such as purity, recovery rate, detection limit, and the performance of each evaluation factor was compared with a commercial nucleic acid extraction kit. Furthermore, the performance of nucleic acid extraction was improved through electrochemical analysis of proposed nanofilter device by applying alternative current, and a commercial membrane filter could be used as a nanofilter membrane for nucleic acid extraction. Chapter 1 is the introductory section, which contains a brief description of DNA extraction of waterborne pathogens for molecular diagnosis. It explains the importance of obtaining pure DNA and explains the principles of conventional nucleic acid extraction kits. In addition, from the perspective of solid-state nanopore research, principles of detecting DNA using nanopore based on electrokinetic transport were introduced. Also, issues of electrical sensitivity of nanopore devices were covered In chapter 2, A nanopore device was presented in which SiNx membrane was transferred to a PDMS microchannel. Additional adhesion force was induced by the hydrophobic interaction of the PDMS microchannel and DNA, which increased the DNA translocation time and improved detection sensitivity to detect DNA passing faster than the instrument's measurement speed. A method of fabricating a PDMS microchannel using micro-contact printing and a method of transferring an ultra-thin SiNx membrane to a microchannel were introduced. For nanopore perforation, controlled dielectric breakdown (CBD) method was used, not ion-beam or electron-beam sputtering, which are widely used for nanopore formation. Owing to the dielectric properties of PDMS, through electrical analysis of the nanopore device, a low-noise of 12.6 pA was achieved under a 100 kHz low-pass filter condition, and an additional adhesion force was generated through the hydrophobic interaction of the microchannel and DNA, resulting in 51 ms of translocation time at 200 mV bias. In chapter 3, a single nanopore was expanded to a multiple nanopore structure, which is intended to be used as a nucleic acid extraction nanofilter membrane for sample preparation for molecular diagnosis of pathogens. To fabricate a nanofilter chip with a 220 nm diameter nanopore array structure, nano-imprint method and semiconductor manufacturing processes such as dry etching and wet etching were used on a free-standing SiNx membrane of 100 nm thickness and 1x1 mm2 size. Genomic DNA was directly extracted from the cell lysate of E. coli O157:h7 bacteria using the prepared nanofilter membrane. To find the optimum extraction conditions, the experiment was conducted at an applied voltage in the range of 1 to 4 V, and H2O2 and HOCl were generated by the electrochemical reaction at the electrode at a voltage exceeding 2 V, damaging the extracted DNA. The detection limit was found through a nucleic acid extraction experiment for each concentration of bacteria and a comparison with a commercial kit, and the PCR efficiency is up to 3 cycles faster than the conventional commercial kit. In chapter 4, the improved performance of the previously developed nanofilter device for nucleic acid extraction (sample preparation) was introduced through electrochemical analysis. The electrical double layer (EDL) formed at the interface between the electrode and the aqueous solution was analyzed as electrochemical components, and the electric field is consumed more than 90% in the EDL, so that a sufficient electric field is not applied to the chamber and filter. Using the characteristic of EDL, which acts like a capacitor whose impedance decreases as the applied frequency increases, the resistance of the interface is reduced by applying an AC current. As a result, the electric field applied to the chamber and the filter increased by more than 10 times, thereby improving the transport rate of DNA by more than 5 times. Through this dissertation, a total solution of molecular diagnosis for pathogen detection is expected, from nucleic acid extraction for sample preparation to detection of nucleic acids using a solid state nanopore platform.

학위논문에서는 수인성 병원체의 분자진단을 위한 핵산추출(시료 전 처리)과정부터, 핵산을 단분자 수준에서 검출하는 솔리드 스테이트 나노 포어 플래폼 (solid-state nanopore platform)에 대해 논의한다. 구체적으로, 나노포어 연구에서 가장 중요하게 생각되는 기술적인 이슈 중 하나인 민감도 향상에 대해 논의되었는데, 시간 해상도(temporal resolution)향상과 신호대잡음비 (signal to noise ratio(SNR)) 향상을 포함한다. 이 기술적 이슈에 대한 이전 연구 결과들을 이 학위논문에 요약하였고, 이 연구들을 기반으로 나노포어 디바이스의 민감도 향상을 이룬 디바이스를개발하였다. 전해질 속에서 음전하를 띄는 핵산이 전기장에 의해 이동한다는 기본적인 물리력을 기반으로, single nanopore에서 multiplenanopore 구조로 확장하여, 이을 시료전처리 과정의 핵산추출을 위한분리막으로 사용하고자 했던 시도들도 이 학위논문에 소개되었고, 이 디 바이스를 나노필터 칩 (nanofilter chip) 으로 명명하였다. 핵산추출 성능의 평가요소로 여겨지는 요소(순도, 회수율, 검출 한계)들이 알아보고, 각각의 평가요소를 상용 핵산추출 키트와 비교하였다. 더 나아가서, 이 나노필터 디바이스의 전기화학적 분석을 통해 핵산추출 성능을 향상시킨내용도 다루었으며, 상용 멤브레인 필터를 핵산추출용 나노필터 멤브레인으로 사용할 수 있음을 밝혔다.1장은 서론으로, 수인성 병원체의 분자진단을 위한 핵산추출에 대한 간략한 설명을 기술하였다. 순도가 높은 DNA를 얻어야 하는 이유를 설명하고 기존 상용 핵산추출 키트의 원리를 설명한다. 나노포어 연구의 관 점에서, 나노포어 디바이스를 이용하여 전기역학적 유동에 의해 DNA를검출하는 방법을 소개한다. 2장은 PDMS 미세유체회로(microchannel) 과 DNA의 소수성 상호작용을이용하여 추가적인 부착력을 유도하여 DNA가 나노포어를 지나가는 시간을 증가시켜 나노포어 디바이스의 민감도를 향상시킨 내용을 소개한다. 미세접촉프린팅 (micro-contact printing)기법을 이용한 미세유체회로를 제작하는 방법, 수십 나노미터 두께의 실리콘나이트라이드(SiNx) 멤브레 인을 미세유체회로에 전사하는 방법을 기술하였으며 널리 사용되는 이온 빔(ion-beam)이나 전자빔(electron-beam) 스퍼터링이 아닌 절연파괴 (dielectric breakdown) 방법을 이용한 나노포어 형성 방법을 소개한다. 완성된 나노포어 디바이스의 전기적 분석을 통해 100 kHz low-pass filter 조건에서 12.6 pA의 낮은 전기적 노이즈를 달성하였고, PDMS 미세유체 회로와 DNA의 소수성 상호작용을 통해 200 mV에서 51 ms의 통과시간 (translocation time)을 달성할 수 있었다. 3장에서는 single nanopore에서 multiple nanopore 구조로 확장하여 이 를 병원체의 분자진단을 위한 시료전처리용 핵산 추출 나노필터 멤브레 인으로 사용하고자 하였던 내용을 소개한다. 100 nm 두께의 1x1 mm2 크 기의 free-standing 실리콘 나이트라이드 멤브레인에 나노임프린트 기술 과 건식식각(dry etching), 습식식각(wet etching) 과 같은 반도체 제조공 정을 이용하여 220 nm 지름의 나노포어 배열구조를 형성하여 나노필터 칩을 제조하는 방법을 소개한다. 제작한 나노필터 멤브레인을 이용하여 대장균(Escherichia coli O157:h7) 박테리아의 세포용해물에서 유전체를 직 접 추출하였다. 최적 추출 조건을 찾기 위해 1~4 V 범위의 인가 전압에 서 실험이 진행되었고, 2 V를 초과하는 전압에서는 전극에서 생성되는 전 기화학 반응에 의해 과산화수소(H2O2) 와 하이포아염소산(HOCl) 이 발생 하여 추출된 DNA를 손상시키는 것을 확인하였다. 박테리아의 농도별 핵 산 추출 실험과 기존 상용 키트와의 비교를 통해 검출한계를 알아내었고, 기존 상용 키트 대비 최대 3 사이클 PCR 효율이 높은 것을 확인하였다. 4장에서는 앞서 개발한 핵산추출용 나노필터 시료전처리 장치의 전기화 학적 분석을 통해 그것의 성능을 향상시킨 내용이 소개되었다. 전극과 수용액의 계면에서 형성되는 전기이중층(electrical double layer, EDL)이 전기화학적 요소들로 분석되었고, 전기장이 EDL에서 90% 이상 소모되어 챔버와 필터에 충분한 전기장이 인가되지 않아 핵산추출 효율이 10% 내 외로 떨어지는 것을 확인하였다. 인가 주파수가 커지면 임피던스가 작아 지는 캐패시터처럼 행동하는 EDL의 특성을 이용하여 교류전류를 인가하 여 계면의 저항을 낮추었다. 그 결과 챔버와 필터에 걸리는 전기장이 10 배 이상 증가하였고 이로 인하여 DNA의 추출 효율을 다섯 배 이상 향 상시킬 수 있었다. 이 학위논문을 통해서 시료전처리를 위한 핵산추출부터, 핵산을 솔리드 스테이트 나노포어 플랫폼을 이용하여 검출하기까지 병원체 분자진단의 토탈 솔루션을 위한 초석을 마련할 수 있을 것이다.