Mechanically Stable Hydroxyapatite Patterning with Biological Functions for Tissue Regeneration

Abstract

인체 내부 뼈의 구성요소 중 하나인 하이드록시아파타이트(HA)는 조직 재생 분야에서 널리 사용되는 유망한 재료로 알려져 있다. 많은 경우에, HA는 기존 조직과의 결합력에 영향을 미치는 생체적합성을 증진시키기 위해 금속 임플란트 표면에 코팅 적용된다. 그러나, 특유의 취성으로 인해, HA는 복잡한 모양의 금속 임플란트나 유연한 고분자 표면에 적용되는데는 어려움이 있다. 바로 이점에서, 마이크로패터닝이 취성이 있는 HA를 표면에 적용하는 대안이 될 수 있다. 포토리소그래피를 이용해 제작한 HA 마이크로패턴은 본 연구진의 새로운 패턴 트랜스퍼링(Pattern transferring) 기술을 이용해 고분자 표면에 도입되었다. 이러한 방법을 이용해, 취성이 강한 HA를 기계적 안정성을 갖는 동시에 증진된 생체적합성을 부여하면서 유연한 바이오 고분자 표면에 적용하는 것이 가능하다. 첫번째 연구에서, 본 연구진은 직선형의 HA 패턴을 실리콘 웨이퍼 상에 제작하고 이후 그 패턴을 튜브 형태의 인공 혈관으로 사용되는 폴리-L-락틱액시드(PLLA) 필름에 트랜스퍼하였다. 생체 활성을 갖는 HA 패턴은 생체내 활성이 적은 고분자 인공 혈관에 생체적합성을 부여하게 된다. 고유의 바늘 형태의 구조를 갖는 HA 패턴이 PLLA 모재에 성공적으로 트랜스퍼되어 박혀있는 것을 확인하였다. HA 패턴화된 PLLA 필름은 HA가 코팅된 PLLA 필름에 비해 우수한 기계적 안정성을 갖는 것을 굽힘, 인장, 그리고 생체 모방 순환 조건 실험으로 알 수 있었다. 따라서 일련의 실험을 통해 튜브 형태의 인공 혈관으로 적용하는데 적합함을 확인하였다. 추가적으로, HA 패턴이 혈관내피세포의 패턴을 따른 증식과 이동을 촉진함으로써 신속한 혈관내피세포화(endothelialization)을 유도하였다. HA 패턴화된 PLLA의 혈액안정성은 표면에 부착된 상대적으로 적은 양의 혈소판을 통해 알 수 있었다. 전반적으로, HA 패턴화된 PLLA는 아무 처리가 되지않은 PLLA에 비해 훌륭한 기계적 안정성뿐 아니라, 증진된 생체적합성과 혈액안정성까지 보여주었다. 두번째 연구에서는, PLLA 골형성유도막(GBR 멤브레인)에 적용된 HA 패턴에 제2형 재조합인간골형성단백질(rhBMP-2)를 담지하는 새로운 방법을 개발하였다. PLLA 멤브레인에 성공적으로 만들어진 HA 패턴을 트랜스퍼하였고 기계적 자극을 줬을때도 고정되고 안정적인 형상을 보여줌을 확인했다. 단백질이 PLLA에 비해 HA 패턴 위와 아래에 명확하게 부착되었고, HA 아래에 담지된 경우에서 7일에 걸쳐 서서히 방출되는 것도 확인하였다. 담지된 rhBMP-2의 양은 HA아래 담지된 샘플(u/HAP)에서 가장 많았고, 이는 반구형 구조를 갖는 HA 패턴의 넓은 표면적 때문으로 보였다. 세포 형상과 증식 결과들은 PLLA 멤브레인에 HA가 미치는 생체적인 효과를 증명해준다. 전조골 세포의 분화(Osteoblastic differentiation) 결과는 14일 동안의 ALP 활성도의 눈에 띄는 증가를 통해 u/HAP에서의 rhBMP-2의 많은 방출량을 입증했다. 동물 실험 결과는 골재생을 유도하는 HA의 영향과 u/HAP에서 많은 양의 rhBMP-2가 방출됨에 따라 연장된 골치유 효과를 보여주었다. 결과적으로, 생체 활성을 갖는 HA 패턴이 만들어지고 PLLA 표면에 트랜스퍼되어 성공적으로 생체적합성을 부여하고 추가적인 약물 담지 기능을 부가하였다. 이와 같은 독특한 패터닝과 트랜스퍼링 기술을 통해, 취성을 갖는 생체재료를 유연한 고분자 멤브레인에 적용가능할 것으로 보이고, 이와 같은 구조를 다양한 조직 공학 분야에 적용할 수 있을 것으로 기대된다.

Hydroxyapatite (HA), a component of human bone tissue, is a promising material which is widely accepted in tissue regenerating applications. In many cases, HA is coated on metal implant surface to enhance biocompatibility for tissue fixation. However, due to its inherent brittleness, HA is hard to be applied on metal implants with complex shape or flexible polymer surface. Here, micro-patterning can be an alternative for surface application of brittle HA. HA micro-pattern fabricated by photolithography was introduced on polymer surface by our novel transferring technique. With this method, brittle HA can be applied on the flexible bio-polymer surface with mechanical stability, imparting enhanced biocompatibility. In the first study, we fabricated a linear HA pattern on a silicon wafer and then transferred the pattern to a poly(L-lactic)-acid (PLLA) film for use as a tubular vascular graft. The bioactive HA pattern can impart biocompatibility on the bio-inert polymeric vascular graft. The HA pattern with its characteristic needle-like shape was successfully embedded into the PLLA. The HA-patterned PLLA film exhibited superior mechanical stability compared with that of a HA-coated PLLA film under bending, elongation, and in vitro circulation conditions, suggesting its suitability for use as a tubular vascular graft. In addition, the HA pattern guided rapid endothelialization by promoting proliferation of endothelial cells and their migration along the pattern. The hemocompatibility of the HA-patterned PLLA was also confirmed, with substantially fewer platelets adhered on its surface. Overall, in addition to good mechanical stability, the HA-patterned PLLA exhibited enhanced biocompatibility and hemocompatibility compared with pure PLLA. In the second study, we developed a noble method to pattern HA loaded with recombinant human bone morphogenetic protein-2 (rhBMP-2) on PLLA for GBR membrane. Successfully fabricated HA pattern was transferred to PLLA membrane with fixed and sound morphology in spite of mechanical stimuli. Protein was obviously attached on and under HA patterns contrary to PLLA and released gradually from under-HA in the long term of 7 days. The amount of loaded rhBMP-2 was overwhelmingly large on under HA sample (u/HAP), attributed to the large surface area of hemispherical HA pattern. Cellular morphology and proliferation results supported the biological effect of HA on PLLA membrane. Osteoblastic differentiation results proved the large amount of rhBMP-2 from u/HAP, representing remarkable increase in ALP activity after 14 days of culturing. Animal experiments demonstrated the prolonged bone healing effect with releasing larger amount of rhBMP-2 under the HA pattern. In conclusion, bioactive HA pattern was fabricated and transferred on PLLA surface, successfully imposing biocompatibility and additional drug loading capability. With this unique patterning and transferring technique, brittle biomaterials are expected to be applied on flexible polymer membrane, which can be employed in various tissue engineering applications.