Biomaterial scaffold and chondrocyte-derived secretome for cartilage repair and regeneration

Abstract

고령화 사회와 비만인구의 증가로 인해 무릎 골관절염을 앓고 있는 환자가 급증하고 있다. 전층 연골 결손은 치료하지 않고 방치할 경우 크기가 커지고 골관절염을 발병할 확률이 높아진다. 이에 따라, 자가 재생능력이 매우 제한적인 연골조직의 재생을 돕거나 촉진하는 치료법이 개발돼야 한다. 전층 연골 결손 부위에 단독 또는 생체활성인자나 세포와 함께 이식 할 수 있는 생체재료 기반 하이드로겔에 대한 연구가 활발히 진행되고 있다. 이러한 하이드로겔은 생체 적합하고 생체모방도가 높아 연골재생을 돕는 미세환경을 조성한다. 골관절염의 경우에는 연골 손상이 광범위하게 나타나기 때문에 연골 결손과는 달리, 연골을 전체적으로 치료해야 한다. 항염증 주입식 하이드로겔에서부터 중간엽 줄기세포까지 다양한 조직공학 전략을 통해 연골 세포 사멸과 연골 파괴를 악화시키는 염증성 환경 완화에 초점을 맞춰왔다. 그러나 이러한 치료법은 이 만성 질환에 대한 영구적인 해결책보다는 일시적 통증을 완화 할 뿐이다.

본 논문에서는 전층 연골 결손과 골관절염으로 인한 연골 손상 보수 및 재생을 위한 조직공학 전략을 구상하였다. 제2 장에서는 전층 연골 결손 재생 및 골유착을 위한 이중층 크라이오겔을 제작 하였고, 제3 장에서는 골관절염 치료를 위한 염증성 및 이화작용 환경을 완화하는 생물학적 약품 개발하였다.

제2장에서는 hyaline 및 hypertrophic 연골 층을 각각 재현하는 이중층 크라이오겔 제작하였다. 상부 층에는 RGD peptide를 포함시켜 연골세포의 표현형 유지와 연골관련 세포외 기질 축적을 도와 hyaline 연골을 형성하였다. 하단 층에는 연골세포 hypertrophy의 유도를 통한 골연골 인터페이스를 구성하고 있는 calcified 연골 층의 형성을 목표하였다. 이는 이식한 engineered cartilage graft의 골유착 및 생착률을 높이기 위한 전략이다. 본 실험에서는 골광질인 whitlockite (WH: Ca9(MgFe)(PO4)6PO3OH)가 연골세포 hypertrophy를 유발할 것이라는 가설을 세웠다. 기존 연구에서 WH가 다른 골광질에 비해 줄기세포 골분화에 의한 골재생을 더 증진시키는 것을 보여줬다. WH가 연골세포 hypertrophy를 유발하는 것을 보고 및 활용하는 첫 번째 연구다. 다른 골광질과는 달리 Ca2+ 및 PO43- 외에도 Mg2+를 특이적으로 방출하기 때문에 연골세포 hypertrophy에서의 Mg2+ 역할도 함께 조사하였고 입증하였다. 더 나아가, 두개골 결점 모델에서 hypertrophic 연골세포가 석회화 된다는 것을 확인하였다. Hyaline-hypertrophic 연골 층을 모방한 이중층 크라이오겔은 각 연골 층의 재생뿐만 아니라 골연골과의 유착을 가능케 해 전층 연골 결손 치료에 적합할거라 기대한다.

제3장에서는 연골세포에서 유래한 분비물에 기초한 골관절염 치료법을 개발하였다. 체외 2차원 배양 환경에서 연골세포는 자연연골과 유사한 환경을 만들기 위해 각종 수용성 인자, 세포외 기질 (ECM) 등을 정상수준보다 많이 분비한다. 다양한 분비물을 함유하여 골관절염에 높은 치료 잠재력을 가질 것이라는 가설을 세웠다. 장기적으로 안정적이게 보관하기 위해 precipitation with compressed fluid antisolvent (PCA) 공정을 통해 연골세포 배양액을 건조시켰다. PCA 공정은 압축된 액체 CO2로 채워진 챔버에 분사하는 것으로, 배양액 방울과 빠르게 혼합되어 포화시켜 배양액 속 secretome이 침전되도록 한다. Park et al.은 PCA로 건조한 MSC 배양액 속 VEGF 활동이 수용액 상태에서 계속 높게 유지되는 것을 증명하였다. 따라서 본 연구의 목적은 1) 골관절 관절에 대한 분비물의 효과와 2) 건조 과정이 분비물의 치료 효능에 미치는 효과에 대한 조사였다. Interleukin-1β를 하루 간 처리하여 얻은 골관절염성 연골세포를 실험 test bed으로 사용하였다. 건조방법과 관계없이, secretome을 골관절염성 연골세포 처리 후 염증 유전자의 유의미한 하향조절과 질소산화물 생산량이 낮아지는 것을 보였다. 그러나 동결건조한 secretome에 비해 PCA공정으로 건조된 secretome을 처리했을 때 콜라겐아제(MMPs)와 아그레카나제(ADAMTs)의 유전자 발현이 더 큰 폭으로 하향 조절됐다. 쥐 골관절염 모델에서 secretome 기반 치료제의 치료 효능을 확인하고 PCA와 동결건조 샘플 간의 치료 효능 정도 차이를 관찰하였다.

이 연구들은 연골 복원 및 재생에 대한 조직공학 전략을 보고한다. 제2 장에서는 WH가 연골세포 hypertrophy를 유발하는 것을 보고 및 활용하는 첫 번째 연구를 소개했다. 제 3장에서는 연골세포 분비물을 골관절염 기전 조사 외에 골관절염 치료제로 활용한 첫 번째 연구이다. 본 연구에서 얻은 새로 지식을 토대로 영구적인 연골 치료제를 만들 수 있을 거라 믿는다.

With the growing elderly and obese populations globally, there is a rapid rise in patients suffering from cartilage-related diseases. In fact, osteoarthritis (OA) is one of the most common musculoskeletal diseases that affected 320 million people worldwide in 2019 1. The prevalence of cartilaginous diseases necessitates the development of treatments that assist or stimulate regeneration of this tissue that inherently lacks self-repair capacity. For focal cartilage defects, tissue engineering approaches have developed biomaterial-based scaffolds that can be implanted at the defect site, alone or in conjunction with bioactive factors (e.g. growth factors) or cells (e.g. chondrocytes or stem cells). Such scaffolds are not only biocompatible, but also highly biomimetic, matching the native environments structural architecture and composition. Full-thickness cartilage defects, if left untreated, may grow in size and increase susceptibility to OA. As in the case of OA, cartilage damage is more widespread and requires a more systemic approach to treatment. Tissue engineering strategies for OA, ranging from anti-inflammatory injectable hydrogels to stem cell-based therapies, have primarily focused on alleviating the highly inflammatory articular environment, which aggravates chondrocyte apoptosis and cartilage destruction. However, palliative therapies provide temporary pain relief rather than a permanent solution to this chronic disease.

In this thesis, I devised tissue engineering strategies to promote repair and regeneration of full-thickness cartilage defect and OA-induced generalized cartilage damage. Occurring through different pathophysiology, different tissue engineering approaches are required for each cartilaginous disease. My thesis consists of two specific aims: i) a bilayer system with hypertrophic cartilage layer that mineralizes into calcified cartilage to facilitate osteointegration for full-thickness cartilage defect repair (in chapter 2) and ii) secretome-based disease-modifying biologic drug to alleviate inflammatory and catabolic environment for OA treatment (in chapter 3).

In chapter two, I have fabricated a bilayer macroporous cryogel with a hypertrophic cartilage bottom layer as an osteochondral interface. Since graft-to-tissue integration does not occur with the cartilage but with the bone, engineering the calcified cartilage interface between hyaline cartilage and subchondral bone is key for osteointegration of engineered cartilage with the underlying subchondral bone. The upper hyaline layer consists of arginylglycylaspartic acid (RGD) peptide to enable cell adhesion onto the scaffold. In addition to RGD peptide, the bottom layer contains whitlockite (WH: Ca9(MgFe)(PO4)6PO3OH) to recreate the calcified interface between the hyaline cartilage and subchondral bone. Previous studies have shown that WH, a magnesium-containing calcium phosphate found in our bones, promotes osteogenesis in bone tissue engineering. I hypothesized that WH would induce chondrocyte hypertrophy for the formation of calcified cartilage layer. Through in vitro and in vivo subcutaneous implantation, I have shown that the upper RGD layer supports not only cell adhesion and proliferation, but also, chondrogenic phenotype maintenance and cartilage ECM accumulation of chondrocytes. Moreover, I have demonstrated that WH-incorporating bottom layer induces chondrocyte hypertrophy in vitro and in vivo, and that Mg2+ may play a key role in this process. The bilayer scaffold system formed distinct type II collagen-high hyaline and type X collagen-high hypertrophic regions upon subcutaneous implantation. In cranial defect model, I have confirmed that hypertrophic cartilage mineralizes in a bone environment. This hyaline-hypertrophic cartilage bilayer arrangement not only mimics the respective cartilage layers, but also promotes graft-to-tissue integration with the subchondral bone, a common problem associated with graft failure.

In chapter three, I have developed an osteoarthritis treatment based on chondrocyte-derived secretome. In a non-native in vitro environment, chondrocytes are compelled to secrete abundant soluble factors, extracellular matrices (ECM) and other factors in order to create a native cartilage-like environment. Chondrocyte-derived conditioned media, a rich concoction of various secretomes, is expected to have high therapeutic potential. To stably retain and preserve secretomes biological activity, conditioned media from porcine chondrocytes were collected and dried using precipitation with compressed fluid antisolvent (PCA) process. In essence, PCA process involves spraying conditioned media into a chamber filled with compressed liquid CO2, which then, quickly mixes with and saturates the conditioned media droplets, leading to precipitation of solutes from the conditioned media. An earlier study by Park et al. demonstrated that PCA-processed mesenchymal stem cell (MSC) secretome samples maintained higher protein activity after reconstitution in water, compared to lyophilized secretome 2. Therefore, the aims of this study were to investigate: 1) the effect of secretome on osteoarthritic joints and 2) the effect of drying process on secretome therapeutic efficacy. In vitro, OA-like chondrocytes showed significant downregulation of inflammatory genes and lower nitric oxide production levels when treated with secretome, regardless of the drying process. However, treatment with secretome dried by different processes both downregulated the gene expression of collagenases (matrix metallopeptidases; MMPs) and aggrecanases (a disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motifs; ADAMTs), but to a higher degree by PCA-processed secretome. In rat medial meniscectomy OA model, I confirmed the therapeutic efficacy of secretome-based treatment, and observed a noticeable difference in the degree of therapeutic efficacy between PCA and lyophilized samples.

Together, these studies report tissue engineering strategies for cartilage repair and regeneration. The study in Chapter 2 is the first to report chondrocyte hypertrophy-inducing effects of WH, and the study in Chapter 3 is the first to apply chondrocyte-derived secretome for OA treatment. I believe that these newfound knowledge hold big promises for more permanent solutions to cartilaginous diseases.