Cross-talks between Nuclear factor erythroid-2-related factor 2 signaling and peroxisome activity in porcine oocyte and embryo by treatment with melatonin and phytanic acid

Abstract

돼지는 장기의 크기 및 생리학적 부분에서 인간과 매우 흡사하여 질병모델 및 이종장기 이식에 있어서 필수불가결한 종으로 꼽히고 있다. 또한 돼지는 다태종으로서, 연구자들에게 비교적 쉬운 접근성을 제공한다. 이러한 연구에 있어서 돼지의 체외생산은 중추적이고, 세분화 시 난자의 체외성숙과 배아의 체외배양으로 나뉘게 된다. 이미 여러 차례 보고된 바 대로, 돼지의 난자 및 배아 배양 시 여러 배양조건과 환경을 통제하여 배양효율을 높이고자 하지만, 아직도 돼지의 생식세포 배양에 있어서의 산화적 스트레스 문제는 완전히 해결되지 못한 상황이다. 이에, 생식세포 배양에 여러 기전들을 작용시키는 방법에 관한 연구가 집중되고 있으며, 그 중 Nrf2는 산화적 스트레스에 특화된 기전으로 알려져 있다. 또 다른 관점으로는, 돼지 생식세포의 배양효율을 높이기 위해 지질대사의 조절이 중요하다는 보고들이 있다. 그리고 멜라토닌과 피탄산은 지질대사를 조절하는 화학물로 알려져 있다. 지질 대사를 통해, 퍼옥시좀 내 존재하는 베타지질 산화가 긴 지방산 또는 지질 방울들을 산화시켜 짧은 지방산으로 만든 뒤, 이를 미토콘드리아로 보내어 최종적으로 ATP가 생산된다. 또한 이 과정에서 Nrf2 기전이 관여한다는 연구가 종종 발표되고 있다. 하여 본 연구는, 돼지 생식세포 내에서의 Nrf2 기전과 퍼옥시좀 활성의 관계와 영향을 알아보고자 수행되었다. 첫 번째로, Nrf2 기전을 활성화하기 위해 멜라토닌을 돼지 배아 배양단계에서 처리하여 배아 내 항산화 메커니즘에 Nrf2 기전의 관여 여부를 조사하였다. 체외 성숙된 난자를 사용하여 체외 수정을 시킨 뒤, 멜라토닌을 배양 배지에 처리하여 배아의 발달을 보고, 면역엽색법과 real time PCR을 통해 유전자 및 단백질 수준의 변화를 연구하였다. 그 결과 10-7 M의 멜라토닌이 돼지 배아발달 증진에 있어서 유의적 효과가 있음을 확인하였고 (P < 0.05), 유전자 및 단백질 수준에서 멜라토닌에 인한 Nrf2 기전의 조절이 확인되었다.이를 통해 멜라토닌이 Nrf2 signaling을 통하여 배양과정에서의 산화를 억제하여 배아발달을 증진시킨다는 사실을 확인하였다. 두 번째로, 피탄산을 이용한 돼지 난자 내 퍼옥시좀 활성을 알아보고자 하였다. 이 실험에서는 돼지 난자에 피탄산을 첨가하여 난자의 체외 성숙과 체외 수정 유래 배아를 생산하고, real time PCR, 면역염색, 그리고 BODIPY 염색을 통하여 퍼옥시좀 활성을 검증하였다. 그 결과, 40μM의 피탄산이 난자의 성숙뿐만 아니라, 난구세포의 확장률 증가와 배아의 발달에도 유의적 효과를 준다는 것을 확인하였다 (P < 0.05). 추가로, 피탄산은 퍼옥시좀 활성에 관련된 유전자, 단백질, 그리고 BODIPY 염색을 통한 지질대사를 유의적으로 증진시킨 것도 확인할 수 있었다 (P < 0.05). 또한 피탄산을 체외배양 시 첨가한 결과, 돼지 배아의 발달률 증가 및 퍼옥시좀의 활성에 유의적인 결과가 나타났다 (P < 0.05). 그러므로 위 연구에서는, 피탄산을 통해 난자의 성숙 및 발달 잠재능력을 유의적으로 증가시킬 수 있으며, 그 과정에서 퍼옥시좀이 중추적으로 관여한다는 것을 밝혀냈다. 세 번째로, 돼지 난자에서 Nrf2 기전의 조절과 이에 대한 퍼옥시좀 활성에 대한 변화를 조사하였다. Nrf2 기의 특이적 억제자인 brusatol의 적정농도를 체외성숙 동안 처리하여 선정하고, 그 후 멜라토닌과 함께 체외성숙 과정에서 다시 한번 공동 처리하였다. 이 실험에서 멜라토닌과 brusatol을 돼지 난자의 체외성숙 단계에서 처리하여, 난구세포 확장률을 검증하고 단일생식 유래 배아를 생산하였다. intracellular적인 검증을 위해 면역염색, real time PCR, RNA sequencing, ATP/GSH/ROS 염색, 그리고 Western blot을 적용하였다. 그 결과, 12nM brusatol이 적정농도로 선정되어 멜라토닌과 함께 처리하였고, 성숙률 및 배아 발달 평가를 통해 각각의 화학물들에 대한 효과들을 유의적으로 확인하였다 (P < 0.05). 이 후, 유전자 및 단백질적 분석을 통해 Nrf2 기전과 퍼옥시좀의 활성이 난자 내에서 활발하게 조절되었음을 확인했을 뿐만 아니라 (P < 0.05), 항산화 기전도 유의적으로 조절되었다. 또한RNA sequencing을 통하여 보다 정확한 관계성을 난자 내에서 확인하였다. 결과적으로, Nrf2 기전과 퍼옥시좀 간의 상호 관계성이 분명히 있고, 난자의 성숙에 있어서 유의적인 영향을 끼친다는 것을 밝혀내었다. 마지막으로, 돼지 배아에서 Nrf2 기전과 퍼옥시좀의 활성에 대한 관계와 이에 따른 지질대사에 대해 조사하였다. 본 연구에서는 체외성숙, 단일생식, real time PCR, 면역염색, 그리고 BODIPY 염색법을 도입하였다. 최종적인 적용을 위해 멜라토닌과 피탄산을 돼지 체외배양 동안 함께 처리하였고, 확실한 확인을 위하여 siRNA를 통한 퍼옥시좀 활성 관련 유전자인 Pex19을 knockdown하였다. 그 결과, 공동처리군에서는 유의적으로 높은 배아발달률을 보였고 (P < 0.05), siRNA 처리군에서는 유의적으로 낮은 배아 발달률을 보였다. 또한 위의 두 처리군을 기준으로, Nrf2 기전과 퍼옥시좀 활성관련 유전자 및 단백질 발현이 조절되었음을 확인하였다 (P < 0.05). 결과적으로, 위 연구를 통해Nrf2 기전과 퍼옥시좀 활성이 돼지 배아 발달에 유의적 영향을 끼치는 것을 밝혀내었다. 결론적으로, 본 연구를 통해 Nrf2 기전과 퍼옥시좀 활성이 각각 돼지 배아 및 난자에 영향을 준다는 것을 확인하였다 (P < 0.05). 그 후, 이 둘의 상호적 관계를, 난자와 배아 내에서 체외성숙, 체외발달, 유전자 및 단백질적 발현을 통해 밝혀내었고, 난자 성숙 및 배아 발달 증진과정에서 중요한 역할을 한다는 것을 제시하였다.

Pigs have been dedicated to biomedical research for models of human disease and xenotransplantation because they share similarities with humans, such as sizes of organs, physiology, as well as diets. Moreover, pigs are a multiparous species that make simple approaches for researchers applicable in in vitro production (IVP). IVP is the fundamental step for producing transgenic animals and in vitro maturation (IVM) of oocytes and in vitro culture (IVC) of embryos, which are the main procedures used during IVP. However, successful IVM and IVC remain unaccomplished. Although well-controlled culture conditions and environments, as well as quality of oocytes and handling are pivotal for improving success rates of IVM and IVC, damages from oxidative stress (OS) on gametes and embryos are considered a major task for research. Numerous trials for preventing OS such as antioxidative chemical treatments or genetic modifications by assisted reproduction techniques have been implemented. Recently, some studies suggested the importance of signaling pathways and their regulations in mammalian oocytes and embryos. The signaling pathways that regulate OS are receiving attention from research and among them, the nuclear factor erythroid-2-related factor 2 (Nrf2) signaling pathway is known to be one of the strongest antioxidative pathways. Another aspect for improving the success rate of IVM and IVC is lipid metabolism regulations within oocytes and embryos. Chemicals such as melatonin and phytanic acid (PA) are known to regulate lipid metabolism in porcine species. It is reported that upregulation of lipid oxidation leads to increased oocyte maturation and embryonic development, in the meantime, producing ATP. Peroxisomal activities such as Peroxin family activation, α- and β-oxidation of fatty acids (FAs), short-chained FA transportation to mitochondria and defense mechanisms against OS are also known to reduce OS and increase ATP production. In addition, there are reports that the Nrf2 signaling pathway is involved not only in antioxidant mechanisms, but also in lipid metabolism in mammalian gametes and embryos. Therefore, this study attempted to investigate a possible synergistic relationship between the Nrf2 signaling pathway and peroxisomal activities in porcine oocytes and embryos. First, in order to investigate whether the Nrf2 signaling pathway is involved in porcine embryos, IVM of porcine oocytes along with in vitro fertilization (IVF) was performed. Melatonin was treated during IVC of porcine embryos and activation of the Nrf2 signaling pathway was evaluated by real time PCR and immunocytochemistry. In addition, brusatol, an Nrf2-specific inhibitor, was also treated during IVC to validate the signaling pathway. As a result, 10-7 melatonin significantly increased the embryonic development and upregulated the Nrf2 signaling pathway (P < 0.05), which was verified by gene and protein expressions in porcine embryos. Therefore, it can be concluded that melatonin mediates the Nrf2 signaling pathway and the pathway is regulated significantly in porcine embryos. Next, the peroxisomal activities in porcine oocytes were investigated. PA is a long and branched FA, which is digested by α- and β- oxidation in peroxisomes, resulting in FA shortening. Subsequently, the short-chained FAs are transported to mitochondria for ATP synthesis. In this experiment, IVM and IVF were performed and real time PCR, immunocytochemistry, staining of reactive oxygen species (ROS) and glutathione (GSH), BODIPY, and mitochondrial membrane potential (MMP) were employed to evaluate the peroxisomal activities in porcine oocytes. Through the selection of optimal PA concentration during IVM, it was found that 40 μM PA significantly increased the maturation rate of oocytes and the cumulus cell expansion rate (P < 0.05). Moreover, PA significantly upregulated the activities of peroxisomes in porcine oocytes, which was tested by gene and protein expressions related to the peroxisomal activities (P < 0.05). Furthermore, lipid metabolism, MMP, and ATP contents were also upregulated by PA (P < 0.05). Therefore, it can in part be concluded that there was strong participation of peroxisomal activities were found in porcine oocytes. The actions of Nrf2 signaling along with peroxisomal activities in porcine oocytes were then investigated. The study was done using IVM with melatonin and brusatol treatment and parthenogenetic activation. Then, real time PCR, immunocytochemistry, ATP and ROS/GSH staining, RNA sequencing, and western blot were used to verify the mechanism. Primarily, the inhibitory effect of brusatol was tested during porcine IVM and it was found that 12 nM brusatol was the optimal concentration. Thereafter, 10-9 M melatonin and 12 nM brusatol were treated on porcine oocytes and then, the embryonic development was evaluated. Gene (including sequencing) and protein expression analysis showed that the peroxisomal activities were significantly upregulated by melatonin and the signal of Nrf2 was also influenced by the activities of peroxisomes (P < 0.05). Thus, it can be concluded that the connection between Nrf2 signaling and peroxisomal activities might be significant in porcine oocytes. For the last experiment, the cross talk between Nrf2 signaling and peroxisomal activities in porcine embryos was investigated. A combination of melatonin and PA was used as treatment during IVC of porcine embryos and Pex19-targeted siRNA was applied to knockdown the peroxisome actions. IVM, parthenogenetic activation, immunocytochemistry, real time PCR, and BODIPY staining were employed in this experiment. As a result, the combination group showed a sharp increase in rates of embryonic development (P < 0.05). Moreover, the knockdown of the peroxisomal activities was clearly observed by gene and protein expressions (P < 0.05). Most importantly, when the combination group was treated with a siRNA-injected group, an effect of recovery was significantly observed by gene and protein expressions (P < 0.05), including staining of ATP, FA, and MMP. In conclusion, it was demonstrated that melatonin and PA treatments mediated the cross talk between the Nrf2 signaling pathway and the peroxisomal activities in porcine oocytes and embryos. Moreover, they influenced lipid metabolism, ATP synthesis, and MMPs. Additionally, the cross talk was found to be effective against OS. Therefore, the regulation of cross talk between the Nrf2 signaling pathway and peroxisomal activities might be indispensable for improvements of porcine oocyte maturation and embryonic development.