Leptin Modulates the Metastasis of Canine Inflammatory Mammary Adenocarcinoma Cells Through Downregulation of Lysosomal Proetective Protein Cathepsin A (CTSA)

Abstract

Canine malignant breast cancers present with a poor prognosis due to metastasis to other organs, such as lung and lymph node metastases. Unlike in human studies where obesity has been shown to increase the risk of breast cancer, this has not been well studied in veterinary science. In our preliminary study, I discovered that leptin downregulated cathepsin A, which is responsible for LAMP2a degradation. LAMP2a is a rate-limiting factor in chaperone-mediated autophagy and is highly active in malignant cancers. Therefore, in this study, alterations in metastatic capacity through cathepsin A by leptin, which are secreted at high levels in the blood of obese patients, were investigated. I used a canine inflammatory mammary gland adenocarcinoma (CHMp) cell line cultured with RPMI-1640 and 10% fetal bovine serum. The samples were then subjected to real-time polymerase chain reaction, Western blot, immunocytochemistry, and lysosome isolation to investigate and visualize the metastasis and chaperone-mediated autophagy-related proteins. Results showed that leptin downregulates cathepsin A expression at both transcript and protein levels, whereas LAMP2a, the rate-limiting factor of chaperone mediated autophagy, was upregulated by inhibition of LAMP2a degradation. Furthermore, leptin promoted LAMP2a multimerization through the lysosomal mTORC2/PHLPP1/AKT pathway. These findings suggest that targeting leptin receptors can alleviate breast cancer cell metastasis in dogs.

현재까지 연구된 바로는 chaperone mediated autophagy (CMA)가 암세포의 생존 및 전이에 중요한 역할을 하는 것으로 밝혀졌다. CMA는 아미노산 서열 내 KFERQ 모티프를 보유한 펩타이드를 표적으로 선택적 자가포식을 수행하는 기전으로, 인간의 유방암에서도 높은 수준으로 발현되는 것으로 알려져 있다. 세포 내 라이소좀의 효소 중 하나인 카텝신 A는 CMA의 속도 조절 인자인 LAMP2a의 반감기를 조절하는 것으로 알려져 있는데, 본 연구의 사전 실험에서 렙틴을 개 유선종양 세포주 (CHMp)에 처리하였을 때 유의적으로 발현이 감소하는 것을 확인하였다. 그러나 지금까지 개의 종양 세포에서 CMA와 카텝신 A 간의 상관 관계는 연구되지 않았다. 따라서 본 연구에서는 렙틴과 그 길항제인 Allo-aca를 적용하여 CMA의 활성 변화를 통해 종양 세포의 침윤 및 전이에 유의적인 변화가 나타나는지 평가하였다.

CHMp 세포주는 RPMI-1640에 10 % 소태아혈청 및 0.5% 겐타마이신을 항생제로서 첨가하여 배양하였다. 본 세포주를 이용하여 12 nM 렙틴, 100 nM Allo-aca를 처리하였으며, 사전실험에서 확인한 카텝신 A를 siRNA transfection을 이용해 Knockdown 하여 카텝신 A 유전자의 종양 전이 향상 평가도 수행하였다. 실험군의 배양은 24시간으로 설정하였고, 이후 시료들은 Real-time PCR, 웨스턴 블랏, 면역세포화학염색, 매트리겔 침윤 시험 그리고 라이소좀 분리에 적용하였다. 세포 증식 실험에서 렙틴은 유의적으로 증식이 촉진되는 효과를 보였으며, Allo-aca의 처리로 증식은 차단되었다. 반면, 카텝신 A KD 세포는 대조군과 비교하여 증식이 유의적으로 억제되었는데, 이는 특정 카텝신 A가 저하될 경우 갈락토시알리오도시스증 (라이소좀축적질환)을 유발함에 기인한 것으로 판단된다. 이에 더하여, Allo-aca의 단독 처리는 CHMp 및 KD 군 모두에서 세포 증식에 영향을 미치지 않은 것을 확인하였다. 다음으로, 렙틴 처리군과 길항제 처리군을 분자수준에서 비교하였을 때, 렙틴 처리군에서 카텝신 A의 mRNA 및 단백질 수준 모두에서 발현 저하가 된 것을 확인하였다. 반면, Allo-aca의 처리군들(단독 및 공처리)은 렙틴의 공처리군에서도 대조군과 비교하였을 때 유의적인 차이를 보이지 않았다.

다음으로, 렙틴 처리군은 침윤 지표(Invasion index) 전이 평가를 위한 실험에서 렙틴은 대조군과 다른 실험군과 비교하였을 때 유의적으로 침윤 지표를 증가시켰다. 이에 더해, 카텝신 A KD 세포주에서 Allo-aca를 처리한 경우 침윤 지표가 감소한 것을 관찰하였다. 웨스턴 블랏 실험을 통한 단백체 분석에서도 종양 전이 관여 인자 중 MMP9, Vimentin의 발현 증가와 E-cadherin의 감소를 확인하였다. 특이하게도, 카텝신 A KD 세포가 CHMp 보다 유의적으로 높은 MMP9 및 Vimentin의 발현 증가를 보였는데 Allo-aca를 처리하였을 때 유의적으로 발현이 감소함을 확인하였다. 즉, 렙틴의 카텝신 A 발현 저하 효과는 Allo-aca의 CTSA 발현 촉진 효과로 상쇄될 수 있음을 시사한다. 이를 분자생물학적으로 검증하기 위한 웨스턴 블랏 실험에서 렙틴은 전사체 (mRNA)와 번역체 (Protein) 수준 모두에서 통계적으로 유의미한 발현 저하를 확인하였고, 이와 동시에 CMA의 속도 조절 인자인 LAMP2a는 카텝신 A 발현 감소에 이차적으로 반감기가 지연됨을 확인하였다. 뿐만 아니라, 렙틴은 라이소좀 막의 mTORC2 / PHLPP1 / AKT 경로를 통해 PHLPP1의 발현 상승 및 pAKT1(ser473)의 생성 억제를 통해 LAMP2a의 중합화를 유도함을 확인하였다. 결론적으로, 본 연구에서는 비만 환자에서 상대적으로 혈중에 고농도로 분포하는 렙틴과 개의 유선종양 전이능 활성화 기전 연구를 위하여 분자생물학적 기전을 통해 검증하는 실험을 진행하였으며, 그 결과 렙틴이 선택적 자가포식의 중요한 조절인자인 카텝신 A 발현 조절을 통한 전이능 활성화를 확인하였다. 또한 렙틴 수용체를 표적으로 하는 Allo-aca의 전이능 완화 효과를 확인하여 앞으로 악성 유선종양에 이환된 반려견 환자들의 종양 연구 및 치료에 활용할 수 있다는 것이 의의가 있다.