Mesenchymal Stem Cells Genetically Engineered to Express Platelet-derived Growth Factor and Heme Oxygenase-1 Ameliorate Osteoarthritis in a Canine Model

Abstract

골 관절염은 노화, 외상, 반복적 스트레스 및 유전적 원인 등 다양한 원인으로 발생하는 질환으로 한번 발병하면 점차 진행해가는 특성을 가지고 있다. 본래 정상 연골 조직은 혈관과 신경이 없는 조직이기 때문에, 어떠한 원인으로 손상을 입어도 자연적으로 재생되기가 힘들며 초기에는 통증 등의 이상 증세를 느끼기 어렵다. 하지만 점차 관절을 움직일수록 더욱 손상이 심화되면서 관절 주변을 감싸는 관절낭, 인대, 뼈 및 근육에도 염증이 발생하고 신경이 유입되게 되면서 비로소 통증을 느끼게 되고 환자의 삶의 질은 결국 떨어지게 된다. 이에 대한 치료법으로서 과거 중간엽 줄기세포는 특화된 다중 분화력을 통해 손상된 부위 조직을 재생할 수 있어 골관절염 치료 방법으로 주목받아왔다. 유전자 변형 기술은 줄기세포의 연골을 포함한 관절 내 구조물들의 치유 효과를 향상시킬 수 있다. 본 연구에서는 개 혈소판유래성장인자 (platelet-derived growth factor, PDGF) 혹은 헴 산화효소-1 (heme oxygenase-1) 유전자를 렌티 바이러스 패키징 기술을 활용하여 개 지방유래 줄기세포 내에 도입하여 개 골관절염 치료 대안으로서의 가능성에 대해 연구하였다. 따라서 본 연구의 목적은 1) 개 혈소판유래성장인자 혹은 헴 산화효소-1 과발현 중간엽 줄기세포가 개 연골세포와 낭막세포와의 상호작용 양상을 확인하고, 2) 개 골관절염 모델에서 관절 내 주입을 통해 안정성과 치료 전후 변화를 평가함으로써 그 효능을 평가하였다. Lipopolysaccharide (LPS) 이용하여 개 연골세포와 낭막세포에 염증을 유발하였고 이는 세포 증식율, 세포 형태 및 실시간 연쇄 중합반응으로 확인하였다. 이 후 개 지방유래 중간엽 줄기세포 (MSCs), PDGF 과발현 중간엽 줄기세포 (PDGF-MSCs), 혹은 HO-1 과발현 중간엽 줄기세포 (HO-1-MSCs)와 공배양하였다. 그 결과 PDGF-MSCs와 HO-1-MSCs에서 LPS에 의해 증가된 염증 인자 (IL-6, IL-1β, TNF-α)와 MMP-13, nerve growth factor (NGF)의 발현이 단독 배양군에 비해 감소하였으며, 개 연골세포에서는 줄기세포와 공배양했을 때 유의적으로 aggrecan과 collagen type 2의 발현이 증가하였다. 또한 aggrecanases (ADAMTS-4, and -5)의 발현이 낭막세포에서 줄기세포와 공배양했을 때 유의적으로 감소하였으며, 그와 반대로 tissue inhibitor of metalloproteinases (TIMP)의 발현은 유의적으로 증가하였다. 이를 통해 염증이 유발된 개 연골세포와 낭막세포에서 개 지방유래 줄기세포와 공배양 시, 관절의 항상성을 유지하는데 기여하는 인자들의 발현이 유의적으로 증가시키는 방향으로 상호작용하였다. 공배양을 진행했던 중간엽 줄기세포 자체의 메신저 리보핵산을 평가 시, 단독 배양에 비해 HGF, TSG-6, FGF-2와 SOX-9 등 연골세포와 낭막세포의 세포 사멸을 억제하는 인자들이 유의적으로 증가되는 것을 확인하였다. In vivo 실험에서 전십자인대 단열을 통해 개 골관절염 모델견을 확립한 뒤 6주 뒤 대조군은 0.9% 생리식염수를, 실험군은 각각 MSCs, PDGF-MSCs, 혹은 HO-1-MSCs를 관절내 주사하였다. 주사 직후 및 10주차 동안 급성 염증 수치(C-reactive protein, CRP)를 측정하고 기본 신체검사를 진행하였으나 기타 이상반응은 발견되지 않았다. 특히 다리 기능 평가 시, PDGF-MSCs를 주입한 그룹에서 대조군에 비해 유의적으로 파행, 부중력 및 통증반응이 개선된 임상증상을 보였다. 하지만 모든 실험군에서 영상학적 평가와 혈청 내 matrix metallopeptidase (MMP)-13 농도를 주입 전과 주입 후 10주 뒤 평가하였을 때 유의적인 차이는 확인되지 않았다. 본 연구 결과를 통해서 개 유전자 변형 중간엽 줄기세포는 염증 환경 내에서 치유에 필요한 조절인자를 분비하고 개 연골세포 뿐만 아니라 낭막세포와 상호 작용을 하는 것을 확인하였다. 이는 염증을 낮추고, 연골을 보호하는 세포외 기질의 항상성을 유지하는 방향으로 진행하였다. 더 나아가 관절내 주입 시 다리 기능이 향상되었고 특히 PDGF-MSCs에서 유의적인 임상증상 개선을 확인할 수 있었다. 이는 기존 치료법이 가지고 있는 한계점을 극복하는 개 골관절염의 새로운 세포 치료제로서의 가능성을 제시한다.

Mesenchymal stem cells (MSCs) are used for the treatment of osteoarthritis (OA), and MSC genetic engineering is expected to enhance cartilage repair. Here, I aimed to investigate the effect of MSCs overexpressing platelet-derived growth factor (PDGF) or heme oxygenase-1 (HO-1) in chondrocytes and synovial cells with an OA phenotype and assess the in vivo efficacy of intra-articular injections of these MSCs in canine OA models. Canine adipose-derived MSCs were transfected with canine PDGF (PDGF-MSCs) or HO-1 (HO-1-MSCs) using lentiviral vectors. Canine chondrocytes or synovial cells were stimulated with lipopolysaccharide (LPS) to mimic the inflammatory OA model and then co-cultured with MSCs, PDGF-MSCs, or HO-1-MSCs for 24 h and 72 h. The mRNA levels of pro-inflammatory, extracellular matrix-degradative/synthetic, or pain-related factors were measured after co-culture by real-time PCR. Furthermore, a surgery-induced canine OA model was established and the dogs were randomized into four groups: normal saline (n=4), MSCs (n=4), PDGF-MSCs (n=4), and HO-1-MSCs (n=4). The OA symptoms, radiographic OA severity, and serum matrix metallopeptidase (MMP)-13 levels were assessed before and 10 weeks after treatment, to evaluate the safety and efficacy of the modified MSCs. PDGF or HO-1 overexpression significantly reduced the expression of proinflammatory factors, MMP-13, and nerve growth factor elicited by LPS and increased that of aggrecan and collagen type 2 in chondrocytes (P < 0.05). In addition, the expression of aggrecanases was significantly downregulated in synovial cells, whereas that of tissue inhibitor of metalloproteinases was upregulated (P < 0.05). Furthermore, the co-cultured MSCs highly expressed genes that contributed to the maintenance of joint homeostasis (P < 0.05). In vivo studies showed that OA symptoms improved after administration of all MSCs. Also, PDGF-MSCs significantly improved limb function and reduced pain (P < 0.05). The results of the radiographic assessment and serum MMP-13 levels did not vary significantly compared to those of the control. Genetically modifying PDGF and HO-1 in MSCs is an effective strategy for treating OA, suggesting that PDGF-MSCs can be novel therapeutic agents for improving OA symptoms.