Structural and functional study of Rv1546 from Mycobacterium tuberculosis

Abstract

Although the mortality rate of tuberculosis (TB) has been improved by the development of anti-TB drugs and prevention tools, TB is still ranked as one of the top 10 global causes of death. Current treatment in TB is challenged by drug resistance which leads to relapse or treatment failure. As to overcome such limitation, discovery of new promising drug targets is being required. Polyketide metabolism associated proteins in Mycobacterium tuberculosis play essential role in survival of the bacterium which makes them potential drug targets. The novel ribonuclease protein, Rv1546 is predicted to be a member of the steroidogenic acute regulatory protein-related lipid-transfer (START) domain superfamily including bacterial polyketide aromatase/cyclases (ARO/CYCs). The structure of Rv1546 was determined from x-ray diffraction analysis at 2.75 Å resolution, belonging to space group P21, with unit-cell parameters a = 55.197, b = 87.518, c =55.907 Å, α = 90.000°, β = 94.510°, γ = 90.000°. X-ray diffraction study confirmed that the protein structure is composed of four α-helices and seven stranded anti-parallel β sheets. The distinct structural feature was found in position of the C-terminal helix of Rv1546. The formation of α-grip fold between C-terminal α-helix and β sheets in monomeric counterpart was found upon homodimerization of Rv1546, which is generally formed within identical monomer. Ribonuclease activity of Rv1546 was investigated for evaluation of the proteins functionalities. Furthermore, site-directed mutagenesis with in vitro RNase activity assays was performed to identify catalytic sites of the protein which suggested that surface residues of R63, K84, K88 and R113 are important.

결핵(Tuberculosis) 치료 약물 및 예방 도구들의 발전으로 결핵으로 인한 사망률이 개선되어왔음에도 불구하고 결핵은 아직도 전세계 10대 사망 원인 중 하나의 질병으로 손꼽히고 있다. 현재 결핵 치료는 약물 내성 균의 등장으로 인해 위협을 받고 있으며, 이때 약물 내성은 치료 실패 및 재발을 야기시킨다. 이러한 한계를 극복하기위해서 새로운 약물 타깃에 대한 발견의 필요성이 대두되고 있다. 결핵균(Mycobacterium tuberculosis)에서 Polyketide 대사에 관여하는 단백질은 균의 생존에 중요한 역할을 하기 때문에 잠재적인 약물 타깃으로 고려된다. 새로운 ribonuclease 단백질, Rv1546은 박테리아의 polyketide aromatase/cyclase를 포함하고 있는 START domain superfamily에 속하는 단백질로 예측된다. Rv1546의 구조는 x선 회절 실험(X-ray crystallography)을 통해 2.75 Å resolution으로 결정되었으며, 이때 space group은 P21, unit-cell parameters는 a = 55.197, b = 87.518, c =55.907 Å, α = 90.000°, β = 94.510°, γ = 90.000°이다. x선 회절 실험을 통해서 이 단백 구조가 4개의 알파 나선(α-helix)과 7개의 베타 병풍(β sheet)으로 이루어진 것을 확인하였다. Rv1546은 C-terminal 알파 나선의 특이적인 위치로 인해 구조적인 특징을 보인다. 일반적으로 START-domain superfamily 단백질들은 단량체 안에서 C-terminal 알파 나선과 베타 병풍이 α-grip fold를 형성하는데, 이와 달리 Rv1546은 homodimer 상태에서 한 단량체의 베타 병풍과 맞은편 단량체의 C-terminal 알파 나선이 αgrip fold를 형성한다. 단백질 기능 실험을 통해서 Rv1546의ribonuclease 활성이 확인되었다. 뿐만 아니라, site-directed mutagenesis와 in vitro ribonuclease 활성 시험을 함께 진행하면서 단백질의 활성 자리(catalytic sites)를 확인할 수 있었다. 표면에 위치한 잔기들인 R63, K84, K88 그리고 R113이 중요하게 역할을 하는 것을 확인하였다.