DNA-affinity purification mass spectrometry to identify B7-H3 regulatory factors in breast cancer stem cells

Abstract

B7-H3, an immune checkpoint molecule, has been considered as a co-inhibitory molecule in T-cell activation. Although B7-H3 is overexpressed in a wide range of human solid cancers and often correlates with negative prognosis and poor clinical outcome in patients, its regulatory roles in regulating the breast cancer stemness, such as tumorigenesis and metastatic potential are not clear. With a preferential expression of B7-H3 in breast cancer stem cells (CSCs), we implemented an immunoprecipitation-mass spectrometry approach for the discovery of transcription factors that are responsible for the regulation B7-H3 expression in breast CSCs. Using the DNA affinity purification–mass spectrometry (DAP-MS) method with selected regulatory regions of B7-H3, we identified several transcriptional factors that interact specifically to the regions along ~1,000 bp of the regulatory sequence of B7-H3. We further validated these transcription factors to assess their roles of regulatory processes on B7-H3 expression in CSCs. Furthermore, blocking a transcription factor (DDB1) with a small-molecule inhibitor broadly decreases B7-H3 expression in vitro, which in turn suppressed the attenuation of tumor sphere formation and cell migration of the breast CSCs. Taken together, our results reveal that DDB1 essentially influences the regulation of B7-H3 expression and suggest that newly discovered transcriptional factors could potentially be developed as new immunotherapeutic targets against breast cancer.

면역 체크 포인트 분자 중 하나인 B7-H3는 T 세포 면역반응을 억제하는 분자로 알려져 있다. 또한, 최근 연구에 따르면 B7-H3는 암 면역 치료제 개발을 위한 대체 치료 표적으로 상당한 주목을 받고 있다. B7-H3는 다양한 인간 고형암에서 과발현되어 있으며 종종 환자의 좋지 않은 예후 및 나쁜 임상 결과와 관련이 있는 것으로 알려져 있지만 종양 발생 및 전이와 같은 유방암의 줄기세포 고유 특성에 대한 조절 역할은 알려져 있지 않다. 본 연구에서는, 유방암 줄기세포 (bCSCs)에서 B7-H3의 발현을 확인함으로써, 유방암 줄기세포에서 B7-H3 전사 조절을 담당하는 전사 인자의 발견을 위해 면역 침전-질량 분석법을 구현했다. B7-H3의 프로모터 영역과 함께 DNA 친화성 침강-질량분석법을 사용하여 1000bp 크기의 B7-H3 조절 서열에 특이적으로 결합하는 몇 가지 전사 인자를 발굴했으며, 녹다운 시스템을 사용하여 암 줄기세포에서 이러한 전사 인자에 따른 B7-H3발현 조절 및 줄기세포 고유 역할을 추가로 검증하였다. 또한, 전사 인자 후보 중 하나인 DDB1에 대한 inhibitor로 알려진 Nitazoxanide (NTZ) 고분자 억제제를 사용해 차단하여 B7-H3 발현을 억제함으로써 종양 형성과 같은 유방암 줄기세포의 고유 특성을 확인하였다. 따라서 우리의 결과는 nitazoxanide가 본질적으로 B7-H3 전사 제어에 영향을 미칠 수 있으며 nitazoxanide가 유방암 줄기세포에 대한 면역 요법의 새로운 표적 역할을 할 수 있음을 보여준다.