인테그린 αvβ3 발현 종양 세포에서 고리형 RGD 펩타이드의 세포 내 유입 연구

Abstract

고리형 Arg-Gly-Asp (RGD) 펩타이드는 피브로넥틴 내의 인테그린(integrin) αvβ3 인식 서열에 대한 결합 분자로 잘 알려져 있다. 암 진단 및 치료를 위해 고리형 RGD 펩타이드 기반 리간드를 사용하여 수많은 결과가 보고되었지만, 암세포에 결합하는 고리형 RGD-인테그린의 뚜렷한 메커니즘과 기능은 여전히 연구 중이다. 특히, 보다 효율적인 진단 프로브와 효과적인 치료제 개발을 위해 세포 내 전달 효율을 높이는 다양한 고리형 RGD 펩타이드 개발이 시도되고 있다. 이 연구에서 우리는 인테그린 αvβ3 과발현 암 세포에서 다양한 유형의 고리형 RGD 펩타이드 (즉, 단량체, 이량체 및 사량체 형태)의 세포 내 유입 효능을 평가하고자 한다. 실험 방법: 웨스턴블롯 및 유세포분석을 사용하여 U87MG 인간 교모세포종 (인테그린 αvβ3 고발현) 및 CT-26 마우스 결장암 (인테그린 αvβ3 저발현) 세포에서 인테그린 αvβ3의 발현을 측정했다. 실험에 사용하기 적절한 cyclic RGD 농도를 확인하기 위해 여러 방식으로 세포 독성 분석을 진행했다. 다양한 유형의 cyclic RGD 펩타이드의 세포 내 유입을 비교하기 위해 형광 염료 (FITC 및 TRITC)로 표지된 cyclic RGD 펩타이드 및 cyclic RGD 펩타이드로 공초점 및 투과 전자 현미경 (TEM) 촬영을 수행했다. 실험 결과: 웨스턴블롯은 U87MG 세포가 인테그린 αvβ3 발현을 가지고 있지만 CT-26은 인테그린 αv 발현 만을 가지고 있음을 보여주었다. 인테그린 αvβ3 인식 항체를 사용한 유세포분석을 통해 U87MG 세포가 CT-26 세포에 비해 상대적으로 높은 인테그린 αvβ3 발현을 나타냈다. 세포 독성 분석으로 모든 cyclic RGD 펩타이드 (0-200 μM)가 U87MG 세포에 대해 적어도 70-80%의 생존력을 가졌다는 것을 확인했다. 아폽토시스 분석을 통해 실험에 사용하는 cyclic RGD 펩타이드 농도에서는 48시간 처리하여도 세포 사멸이 일어나지 않음을 확인하였다. Cyclic RGD 이량체 펩타이드의 형광 이미지는 cyclic RGD 단량체 및 사량체 펩타이드에 비해 가장 높은 세포 내 유입을 보여 주었다. 투과 전자 현미경 결과는 cyclic RGD-인테그린의 세포 내 유입을 명확하게 시각화하였고, 공초점 현미경 결과와 상관 관계가 있다고 확인하였다. 결론: 이러한 in vitro 데이터에서 고리형 RGD 다량체 형태가 단량체 화합물에 비해 인테그린 αvβ3를 통해 세포 내 유입되는 능력이 증가할 것으로 예상됨을 시사한다. 이러한 결과는 인테그린 αvβ3 가 풍부한 교모세포종의 영상화, 진단 및 치료를 위해 고리형 RGD 다량체 펩타이드를 사용하는 근거를 뒷받침한다.

IThe cyclic Arg-Gly-Asp (cyclic RGD) peptide is well-known as a binding molecule to the integrin αvβ3 recognition sequence within fibronectin. Although numerous results have been reported by usage of cyclic RGD peptide-based ligands for cancer diagnosis and therapy, but the distinct mechanisms and functions of cyclic RGD peptide-integrin binding to cancer cells are still being investigated. Particularly, in order to develop more efficient diagnostic probes and effective therapeutic drugs, there have been attempts to develop various cyclic RGD peptides that increase the efficiency of intracellular delivery. In this study, I evaluated the internalization efficacy of different types of cyclic RGD peptides (i.e., monomer-, dimer- and tetramer form) in integrin αvβ3-overexpressing cancer cells. Methods:Western blot and flow cytometric analysis were used to measure the expression of integrin αvβ3 in U87MG human glioblastoma (high-expression) and CT-26 mouse colon cancer (low-expression) cells. Cytotoxicity analysis was performed to determine the appropriate cyclic RGD concentration for use in the experiment. To compare the cellular internalization of different types of cyclic RGD peptides, confocal microscopy and transmission electron microscopy (TEM) imaging were performed with fluorescent dyes (FITC and TRITC) conjugated cyclic RGD peptides. Results: Western blots showed that U87MG cells has integrin αvβ3 expression but CT-26 only has only integrin αv expression. Flow cytometry analysis with an integrin αvβ3 recognizing antibody demonstrated that U87MG cells exhibited relatively high integrin αvβ3 expression. In contrast, CT-26 did not show integrin αvβ3 expression. Cytotoxicity assay indicated that all cyclic RGD peptides (0-200 μM) had at least 70 - 80% of viability to U87MG cells. Through apoptosis analysis, it was confirmed that apoptosis did not happen even after 48 hours of treatment at the concentration of cyclic RGD peptide used in the experiment. Fluorescence images of cyclic RGD dimer peptides showed the highest cellular internalization compare to cyclic RGD monomer and tetramer peptide. TEM results clearly visualized the endocytic cellular internalization of integrin αvβ3 and correlated with confocal microscopic results. Conclusion: These in vitro data suggest that the cyclic RGD dimeric forms are expected to have an increased ability to internalize through integrin αvβ3 compared to their monomeric counterpart. These results support the rationale for the use of cyclic RGD dimer peptides for imaging, diagnosis, and therapy of integrin αvβ3-rich glioblastoma.