Exosomal miR-193a and let-7g accelerate cancer progression on primary colorectal cancer and paired peritoneal metastatic cancer.

Abstract

Colorectal cancer has the third highest incidence rate worldwide, and one of the various forms of colorectal cancer metastasis is metastasis to the peritoneum. A peritoneal metastasis of colorectal cancer is difficult to diagnose, and has a poor prognosis. Trans-mesothelial metastasis is a mechanism of peritoneal metastasis caused by contact with the peritoneum, and exosomes involved in cell-to-cell interaction are considered to play a crucial role in the cancer microenvironment and epithelial-mesenchymal transition. Therefore, this study tried to elucidate clinically the possibility of exosomal miRNA as diagnostic and prognostic marker. Exosomal miRNA was extracted and analyzed by miRNA microarray. The expression of exosomal miR-193a in the PTM group was lower than that of the primary CRC group, and the expression of exosomal let-7g was higher than that of the primary CRC. After selecting target genes of miR-193a and let-7g using the miRNA database, mRNA expression was confirmed for MMP16 and CDKN1A. When the mimics of these two exosomal miRNAs were treated with cell lines, both MMP16 and CDKN1A (targets of miR-193a and let-7g) decreased intracellular expression. A cell invasiveness and proliferation assay were conducted to confirm the physiological role of the miR-193a and the let-7g. Cell invasiveness and proliferation were decreased by miR-193a and increased by let-7g. The differences in expression of exosomal miR-193a and let-7g extracted from the plasma of patients were classified as cancer progression indicators. Decreased miR-193a and increased let-7g were seen as cancer progression indicator. Furthermore, the survival rate decreased in the group with low miR-193a expression and high let-7g expression. This study elucidated the possibility of using this as a diagnostic and prognostic marker for colorectal cancer by measuring the expression levels of exosomal miR-193a and let-7g in blood.

대장암은 모든 암 질환을 통틀어 세계에서 세 번째로 많은 발병률을 보이고 있으며, 2035년까지 240만명 가량이 발생할 것으로 내다보고 있다. 대장암이 전이 및 재발이 되는 곳 중의 하나인 복막은 다수의 신경, 혈관과 림프관들이 연결되어 있다. 대장암이 재발하거나 전이가 일어나는 곳 중에서 두 번째로 빈번한 곳이 복막으로 알려져 있다. 대장암의 복막 전이는 다른 장기로의 전이에서 흔히 보이는 lymphatic metastasis와 복막 전이에서만 독특하게 나타나는 mesothelial metastasis로 나누어진다. 복막 전이가 일어난 대장암 세포들은 크기가 매우 작고 납작한 형태로 퍼져서 자라는 특징이 있다. 복막 전이 초기에는 computed tomography (CT)나 positron emission tomography (PET)등 시각적 진단기법으로는 파악하기가 매우 까다롭고 힘들어서 대장암이 말기까지 진행된 뒤 발견되는 경우가 많다. 최근에는 Hyperthermic intraperitoneal chemotherapy (HIPEC) 과 second-look surgery를 통한 치료법이 시행되고 있으나, 예후가 좋지 않을뿐더러 복막 전이 암의 경우 대장암의 systemic therapy에도 상대적으로 강한 내성을 보이는 경향이 있다. 이러한 위험에도 불구하고 대장암이 다른 장기로 전이가 된 경우에 대한 연구는 활발히 이루어지고 있는 반면, 원발 대장암의 복막 전이에 대한 유전자적 분석에 대한 연구는 상대적으로 부족한 편이다. 대장암과 관련된 최신 연구들의 동향은 환자 혈액의 액상 생체 검사를 통해 항암제 내성, 재발 및 전이의 가능성에 대해 비교적 빠른 시간에 파악하고 대응하고자 하는 방향으로 이루어지고 있다. 액상 생체 검사의 표적 중 하나로 exosome이 있는데 exosome은 세포가 분비하는 extracellular vesicle 중 지름이 30 ~ 150 μm 사이의 vesicle로 알려져 있으며, 세포 내의 다양한 핵산 물질과 단백질을 함유하고 있다. 또한 exosome은 다양한 경로를 통해 비교적 쉽게 다른 세포 내로 흡수가 가능하여 한 세포가 분비한 exosome 내 함유 성분들이 다른 세포로 흡수되어 신호 전달 체계에 영향을 주는 것으로 알려져 있다. Exosome 내의 물질 중에서 microRNA는 전체의 약 1 ~ 5%로 매우 적은 비중을 차지하는 반면, RNA를 직접적으로 억제할 수 있는 기능을 가지고 있어서, 세포의 신호 전달 체계에 중요한 역할을 수행한다고 알려져 있다. 실제로 다른 암 종에서 exosomal microRNA가 암 세포 특성 변화 (epithelial-mesenchymal transition) 및 암 미세환경에 중요한 역할을 수행한다는 연구결과들이 발표되었다. 따라서 exosomal microRNA가 독특한 전이 기작을 가지고 있는 대장암의 복막 전이 과정에서 암 세포의 특성변화와 암 미세환경에 중요한 역할을 수행할 것으로 기대했으며, 따라서 동일 환자 유래의 원발 대장암과 복막 전이 암 세포주에서 유의적인 차이를 보이는 exosomal miRNA들을 발굴하여 대장암의 복막 전이 과정에서의 명확한 역할을 밝히고 나아가서 진단 및 예후를 확인할 수 있는 지표로써 임상적인 의미를 가질 가능성을 확인하고자 하는 목표로 연구를 진행하게 되었다. 동일 환자 유래 원발 대장암 세포주와 복막 전이암 세포주에서 추출한 exosomal miRNA를 microarray 기법을 통해 유의적인 차이를 보이는 miR-193a와 let-7g를 선별했다. 이들은 원발 대장암에 비해 복막 전이암에서 miR-193a의 발현은 감소했고, let-7g의 발현은 증가했다. Exosomal miR-193a와 let-7g의 표적 유전자로 각각 MMP16과 CDKN1A가 선별되었으며, qRT-PCR 기법을 통해 이들 miRNA들이 유의적으로 MMP16과 CDKN1A의 RNA 발현을 억제한다는 것을 확인했다. 생리학적인 기능을 파악하기 위해 두 miRNA들의 유사체를 세포주에 주입했으며, exosomal miR-193a에 의해 암세포의 침투능과 증식은 감소했고, exosomal let-7g에 의해 암세포의 침투능과 증식이 증가했다. 이 결과들을 바탕으로 실제 대장암 환자의 혈액에서 추출한 exosomal miRNA들로 진단 및 예후와 관련된 요소들에 따라 miRNA의 발현양을 확인했다. Exosomal miR-193a의 발현은 대장암 진행단계 높아짐에 따라 감소했으며, exosomal let-7g의 발현은 증가했다. 또한 exosomal miR-193a의 발현이 상대적으로 낮은 집단은 높은 집단에 비해 생존률이 유의적으로 떨어졌으며, exosomal let-7g의 발현이 상대적으로 높은 집단은 낮은 집단에 비해 생존률이 역시 떨어졌다. 결론적으로 대장암의 exosomal miR-193a의 발현 감소와 let-7g의 발현 증가는 세포침투능과 세포증식을 유발하여 복막 전이를 가속화 시켰고, 실제 대장암 환자의 생존률 또한 감소시켰다. 따라서 혈액을 통해 추출 가능한 exosomal miR-193a와 let-7g는 임상적으로 진단 및 예후를 판단하는 지표로써의 높은 가능성을 확인할 수 있었다.