육종 세포주에서 방사선 민감제 타겟으로 NUP62의 이용 가능성에 대한 탐색 연구

Abstract

배경: 육종의 수술적 절제가 어려운 경우 방사선 치료의 역할이 중요하나, 방사선에 반응성이 낮아 치료효과가 제한적이며 예후가 불량하다. 방사선 치료의 효과를 증가시킬 수 있는 민감제에 대한 연구는 일부 상피성 암종을 대상으로 진행된 바 있으나, 육종에서의 연구는 매우 드문 실정이다. NUP62는 Nuclear pore complex를 이루는 구성체 중 하나로, 상피성 암종의 세포주를 이용한 연구에서 방사선 민감제(radiosensitizer)의 가능성에 대한 보고가 있으나 육종에서는 연구된 바가 없다. 본 연구에서는 육종에서 방사선 민감제의 잠재적 타겟으로 NUP62의 역할을 탐색하고자 한다. 방법: 5개의 육종 세포주 (활액막 육종 [SW982], 섬유 육종 [HT-1080], 횡문근 육종 [RH30], 유잉 육종 [A673], 골육종 [KHOS/NP])와 1개의 정상 섬유아세포주(HDF)를 이용하였다. NUP62의 발현 및 NUP62의 siRNA를 이용한 역형질 주입 방식으로 유전자 발현 억제를 유도하였고 NUP62의 발현을 western blot을 통하여 확인하였다. 방사선 민감도의 증가를 확인하기 위하여 NUP62의 siRNA와 대조군 siRNA를 이용하여 각각의 세포주에 형질 주입시킨 후 전리 방사선 조사를 시행하고 세포 사멸과 증식에 대한 평가를 CCK-8 assay와 colony formation assay를 통하여 각각 시행하였다. NUP62의 억제가 방사선 민감도를 증가시키는 기전을 확인하기 위하여 세포 자멸사와 DNA 손상에 대한 평가를 Annexin V-FITC/propidium iodide flow cytometry assay, 세포 자멸사 관련 물질 western blot, gamma H2AX assay를 통해 확인하였다. 결과: 5개의 육종 세포주와 1개의 섬유아세포주 모두에서 NUP62의 발현과 siRNA를 이용한 유전자 발현 억제를 확인하였다. 전리 방사선 조사 없는 NUP62의 단독 발현 억제는 SW982 세포주에서 세포 사멸과 증식에 유의미한 영향을 주지 않았다. 활액막 육종, 섬유 육종 세포주에서 NUP62의 발현 억제는 방사선 조사 후 세포사 억제 단백질인 BCL-2의 발현을 조절함으로써 세포 자멸사를 증가시키고 colony formation assay에서 세포 증식을 떨어뜨림을 확인하였다. NUP62 발현 억제 후 방사선 민감도가 증가했던 세포주 중 CCK-8 assay와 colony formation assay에서 유의미한 차이를 보인 활액막 육종과 섬유 육종 세포주에서 gamma H2AX assay를 시행하였으며 gamma H2AX의 발현이 대조군에 비하여 증가되어, DNA 이중 나선 손상이 증가됨을 확인할 수 있었다. 또한 손상된 DNA 이중 나선의 회복이 대조군보다 지연되어 DNA 이중 나선의 손상 및 회복 기전에 영향을 주는 것을 확인할 수 있었다. 결론: 본 연구에서 NUP62는 방사선 치료에 저항성을 보이는 것으로 알려진 활액막 육종, 섬유 육종과 같은 육종 세포주에서 세포 자멸사를 유도하고, DNA 이중 나선 손상 회복 기전에 영향을 줌으로써, 방사선 민감제의 타겟으로 잠재적인 가능성을 확인할 수 있었다. 세포주를 이용한 본 예비 연구의 결과를 바탕으로 추후에 후속 연구를 통하여 육종의 방사선 민감제의 스크리닝과 개발을 위한 기초 자료로 활용할 수 있을 것으로 기대된다.

Background: Patients with unresectable sarcoma are often refractory to radiotherapy, leading to a poor prognosis. Outcomes of those patients can be improved if effective radiosensitizers are available. NUP62, a constituent of the nuclear pore complex, is known to have radiosensitizing effects in carcinoma cells; however, its effect in sarcoma has never been tested. In this in vitro study, we aimed to investigate the role of NUP62 as a potential molecular target for radiosensitization in human sarcoma cells. Materials and methods: To test cell viability, we used a colony formation assay; NUP62 was silenced and exposed to ionizing radiation (IR) in 5 sarcoma cell lines and 1 fibroblast cell line. Apoptotic cell death and DNA double-strand breaks were then evaluated with fluorescence-activated cell sorting analyses, western blots, and gamma-H2AX assays. Results: We identified the expression and silencing of NUP62 in 5 sarcoma cell lines and 1 fibroblast cell line. NUP62 depletion alone without IR did not affect cell viability and proliferation. We identified an increased rate of cell death by apoptosis, and decreased cell proliferation after NUP62 depletion following IR in synovial sarcoma and fibrosarcoma cell lines. Increased DNA damage was also observed in synovial sarcoma and fibrosarcoma cell lines after NUP62 depletion and IR. However, we noted that NUP62 depletion did not radiosensitize Ewing sarcoma, osteosarcoma, and normal human fibroblast cells. Conclusions: We identified the feasibility of NUP62 as a potential target for radiosensitization in certain sarcoma cells, which have been considered radio-resistant tumors. Our preliminary results can be utilized as a basis for future screening and development of radiosensitizers in sarcoma.