Functional dissection of the CHFR-p53 network in cell fate determination

Abstract

p53은 게놈 수호자 (the guardian of the genome)라고도 불리는 세포 내 대표적인 항암 단백질로 세포 내외의 다양한 스트레스에 반응하여 세포 주기 정지 (cell cycle arrest), DNA 수리 (DNA repair), 세포 자살 (apoptosis) 등의 반응을 유도하여 게놈의 안정성 유지와 암 발생을 억제한다. 따라서 세포 스트레스에 반응한 p53의 안정성 및 활성은 엄격하고 적절히 조절돼야 하며 실제 이와 관련된 연구가 활발히 진행되고 있다. 대표적으로 인산화 (phosphorylation), 아세틸화 (acetylation), 유비퀴틴화 (ubiquitination)와 같은 번역 후 변형 (posttranslational modification)을 통한 조절 기전이 가장 잘 알려져 있다. 정상 상태에서 p53은 p53의 대표적인 음성조절자 (negative regulator)이자 유비퀴틴 결합 효소 (ubiquitin E3- ligase)인 MDM2에 의해 유비퀴틴화 되며, 26S 프로테아좀 (26S proteasome)에 의한 분해로 인해 낮은 수준으로 유지된다. 하지만 세포 내외의 다양한 스트레스에 노출된 경우 p53은 인산화 및 아세틸화로 인해 MDM2로부터 떨어져 나가 안정화되어 축적된다. 특히, ATR/ATM과 Chk1/Chk2 등의 키나아제 (kinase)에 의한 인산화는 MDM2와의 결합력을 저해할 뿐만 아니라 p300/CBP와 같은 아세틸화효소 (acetyltransferase)를 불러오는 기능도 수행한다. p300/CBP는 MDM2에 의해 유비퀴틴화 되는 라이신 잔기 (Lys370, Lys372, Lys373, Lys381, Lys382, Lys386)에 아세틸화를 유도하며 위치 선점을 통해 MDM2에 의한 p53의 유비퀴틴화 및 분해를 억제한다. 또한, 아세틸화는 p53의 세포 내 위치에 영향을 줄 뿐만 아니라 전사 활성을 촉진하는 역할도 수행한다. 안정화 및 활성화된 p53은 전사인자 (transcription factor)로써 세포 주기 정지, DNA 수리, 세포 사멸 등과 연관된 유전자의 발현을 증가시킨다. 이처럼 p53의 역할과 안정성 및 활성을 조절하는 기전에 관해서는 많은 연구가 진행되었지만, 현재까지 풀리지 않는 의문점이 존재한다. p53은 흥미롭게도 세포 주기 정지 및 DNA 수리로 대표되는 세포 생존 (cell survival)과 세포 자살로 대표되는 세포 사멸 (cell death)을 모두 초래할 수 있다. 하지만 어떻게 p53이 세포 스트레스에 반응하여 상반된 두 세포 운명을 결정하고 조절하는지는 아직 잘 알려지지 않았다. 본 연구는 p53의 새로운 조절자로 CHFR을 동정하였으며 p53에 의한 세포 운명 결정에 있어 CHFR의 역할을 확인하였다. CHFR은 유사분열 스트레스 (mitotic stress)에 반응하여 유사분열 전기로의 진행을 늦추는 점검 지점 단백질 (checkpoint protein)로 처음 알려졌다. 이후 여러 후속 연구를 통해 CHFR이 유비퀴틴 결합 활성을 가지고 있으며 실제, 세포 내 다양한 단백질의 안정성을 조절하는 것이 확인되었다. 특히, Aurora A, Plk1, HDAC1, SIRT1의 안정성을 저해함으로써 항암 단백질의 임무를 수행하고 있음이 확인되었다. 하지만 실제 여러 암세포에서 CHFR은 프로모터 부위의 과메틸화 (hypermethylation)에 의해 매우 낮게 발현되거나, 또는 발현되고 있지 않음이 보고되었으며 CHFR이 발현되지 않는 경우 게놈 (genome) 안정성 저하, 암 발생 증가와 같은 현상이 나타남을 확인하였다. 이러한 연구결과는 CHFR이 항암 단백질로서 필수적인 임무를 수행하고 있음을 의미한다. 따라서 CHFR이 가지는 중요성을 바탕으로 CHFR의 기능연구는 암 억제 및 치료제 개발에 있어 필수적인 부분이다. 본 연구는 CHFR이 p53과 직접 결합하며, CHFR이 가진 효소 활성을 통해 p53을 안정화하는 것을 확인하였다. 또한, 실제 CHFR이 p53을 비분해 유비퀴틴화 유형인 Lys63-linked 유비퀴틴화 시키는 것을 규명하였다. p53은 지금까지 알려진 CHFR의 기질 (substrate)들과는 다르게 CHFR에 의해 안정성이 증가하는 첫 번째 사례라는 점에서 큰 의미를 지니고 있다고 생각한다. CHFR은 p53에 대해 MDM2와의 경쟁적 결합 및 유비퀴틴화 위치 선점을 통해 MDM2에 의한 p53 안정성 저해를 억제하는 것을 확인하였으며 이는 MDM2에 대한 특이적인 현상임을 확인하였다. 또한, CHFR-p53 네트워크가 가지는 생리적 기능에 관해 확인하고자 DNA 복제 스트레스를 유도하는 Doxorubicin을 처리하여 연구를 수행한 결과, 세포 스트레스 상황에서 CHFR이 있는 경우 p53 및 세포 사멸 유도 단백질인 Bax의 발현 증가 및 안정화 지속시간이 더욱 증가함을 확인하였으며 또한, 흥미롭게도 세포 스트레스가 강한 경우 CHFR에 의한 효과는 더욱 증대되는 것을 확인하였다. 안정화된 p53은 MDM의 발현 또한 증가시키는 것으로 알려져 있는데 이는 안정화된 p53을 정상 수준으로 되돌리기 위한 기전이다. MDM2-p53의 음성 되먹임 (negative feedback) 관계에서 CHFR은 MDM2에 의한 p53 분해를 억제함으로써 지속적인 p53의 안정화를 유도하는 것을 규명하였다. 이러한 관계를 바탕으로 CHFR-p53 네트워크는 세포 사멸 증가, 세포 성장 억제, 암 형성 억제를 유도하는 것을 확인하였다. 이러한 사실을 통해 본 연구는 CHFR에 의한 p53의 새로운 조절 기전을 밝힘으로써 세포 스트레스 상황 시, p53을 통한 세포 운명 결정에 있어 CHFR이 핵심적인 키잡이 임무를 수행하고 있다는 사실을 규명하였다.

p53 protein plays a prominent role in response to a variety of cellular stresses. Especially, p53-mediated cell cycle arrest, DNA repair, and apoptosis are mightily important mechanisms to prevent cancer development. Therefore, studies on the regulatory mechanisms of p53 stability and activity under cellular stress conditions are extremely significant part in the field of cancer research. Although the function and regulatory mechanisms of p53 are relatively well studied, unsolved questions still exist. Interestingly, p53 could induce both cell survival represented by cell cycle arrest and DNA repair, and cell death represented by apoptosis in response to cellular stresses. However, the regulatory mechanisms of p53-mediated cell fate determination are still elusive. In this study, CHFR is identified as a novel regulator of p53 to explain this question. CHFR, a mitotic checkpoint protein, plays a notable role in cell cycle progression, tumor suppression, and metastasis through its E3-ligase activity. According to previous results, unfortunately, CHFR is frequently silenced in various cancer cells by CpG hypermethylation-dependent silencing of the promoter region. Moreover, CHFR knockout mice have increased skin tumor occurrence, chromosome instability, aneuploidy, and defective chromosomal segregation. These studies imply that CHFR is highly significant in tumor suppression, and it is essential to define an additional function of CHFR. Here, I report that CHFR directly interacts with p53 and induces p53 stabilization using its E3-ligase activity. Also, CHFR can effectively ubiquitinate p53 through Lys63-linked ubiquitination. Unlike previous substrates of CHFR including HDAC1, SIRT1, and Aurora A, p53 is stabilized by CHFR. Therefore, p53 stabilization is highly meaningful as a first case which is stabilized by CHFR. Moreover, it is also confirmed that CHFR effectively inhibits MDM2-mediated p53 destabilization through binding competition with MDM2 and preoccupancy of MDM2-mediated ubiquitination sites. Consistent with these results, CHFR enhances p53 stability and expands a stabilization time under cellular stress conditions. Although stabilized p53 appears to be return to normal state when cells are exposed to sub-lethal damage, p53 is continuously stabilized by CHFR under lethal damage conditions. Although MDM2 is expressed by stabilized and activated p53 to inhibit sustainedly stabilization of p53, CHFR effectively inhibits MDM2-mediated p53 destabilization resulting continuous p53 stabilization, which leads to apoptosis, cell growth inhibition, and tumor suppression. I integrate these findings to show the pivotal role of CHFR in p53-mediated cell fate determination. Altogether, these evidences suggest that the CHFR-p53 network plays a critical role in cancer development and could be provide new therapeutic target.