Gene regulation by nuclear enzyme Aconitase 2 in Schizosaccharomyces pombe

Abstract

생물체는 환경 변화를 감지함과 동시에 유전자 발현을 조절하는 효율적인 방식을 고안해왔다. 포유류의 aconitase와 같이 다기능(moonlighting) 대사 효소를 통한 유전자 조절이 대표적인 예이다. 미토콘드리아 TCA 회로 효소로 잘 알려진 aconitase는 세포 내 철이 부족할 경우 이를 인식하고 iron regulatory protein (IRP)로 작용하여 철 항상성과 관련된 mRNA의 발현을 조절한다. Aconitase의 다양한 기능은 박테리아부터 척추동물까지 여러 모델 생물체 내에서 보고된 바 있으나, 분열성 효모 Schizosaccharomyces pombe 내에서는 아직 많이 밝혀지지 않았다. 본 연구팀에서는 분열성 효모 내 aconitase 2 (Aco2)가 미토콘드리아 외에 핵 또는 세포질에도 존재함을 최초로 보고하였고, 미토콘드리아 내 Aco2는 미토콘드리아 단백질의 번역, 핵 내 Aco2는 heterochromatin 형성에 영향을 미친다는 사실을 밝혔다. 본 논문은 이에 대한 후속 연구로, 핵 내 존재하는 Aco2의 또 다른 기능을 찾기 위해 Aco2의NLS (nuclear localization signal)를 제거한 균주(aco2ΔNLS)를 이용하여 전사체 분석(genome-wide transcriptome analysis)을 수행하였다. 야생형 균주와의 유전자 발현양을 비교분석한 결과, Aco2 NLS 결손 균주에서 유전자 발현이 크게 변화하는 유전자군으로 철 흡수 수송체 및 전자전달계 관련 유전자들이 발견되었다. 철은 세포 내 필수적인 원소이나 과다하게 존재할 경우 활성산소를 만들어 세포를 손상시킨다. 따라서 세포 내 철 항상성 유지는 매우 중요하고 철 흡수 유전자들의 발현은 Fep1과 같은 전자억제인자에 의해 철저하게 조절된다. 그러나 Aco2 NLS 결손 균주에서는 철이 부족한 환경이 아님에도 불구하고 Str1, Str3, Shu1과 같은 철 흡수 mRNA의 발현이 증가해 있었다. mRNA decay assay를 통해 Aco2 NLS 결손 균주에서는 철 흡수 mRNA의 분해가 지연되어 세포 내 축적된 것이라는 것을 알 수 있었다. UV crosslinking RNA-IP (CLIP) 실험으로 Aco2가 철 수송 mRNA들과 직접 결합함을 관찰하였고, RNA 분해효소들 중 Rrp6와 상호작용함을 co-IP로 확인하였다. 따라서 핵 내 Aco2는 철 흡수 mRNA들이 RNA 분해효소에 의해 적절하게 분해되도록 도움으로써 세포 내 철 항상성 유지에 기여한다고 생각된다. 또한 Aco2는 세포 호흡과 관련된 유전자들의 발현도 조절한다. 전사체 분석 결과 Aco2 NLS 결손 균주에서 미토콘드리아 내 ATP 합성과 관련된 전자전달계 유전자들의 발현이 크게 감소하는 것으로 나타났다. 전자전달계를 구성하는 단백질 유전자들은 대부분 핵 내 염색체에 코딩되어 있고 일부만 미토콘드리아 DNA에 코딩되어 있다. Aco2 NLS 결손 균주에서는 특히 핵 내 코딩되어 있는 전자전달계 유전자들의 발현이 전체적으로 감소하였고, Qcr2, Cox13같은 전자전달계 단백질의 양도 감소하였다. 세포 호흡이 요구되는 배지(non-fermentable carbon source media) 조건에서Aco2 NLS 결손 균주의 생장이 크게 저해되는 것을 보아, 핵 내 Aco2는 전자전달계 유전자들의 발현을 조절함으로써 세포 호흡까지 영향을 미치는 것으로 예상된다. mRNA decay assay 결과 전자전달계 mRNA들의 분해속도는 야생형 균주에 비해 별 다른 차이가 없었으므로, Aco2가 이 유전자들을 전사 과정에서 조절함을 짐작할 수 있다. 구체적인 조절 기작에 대해서는 추가 연구가 필요하다. 본 논문에서는 분열성 효모 내 Aco2가 핵 또는 세포질에서 철 항상성 유지 및 세포 호흡과 관련된 유전자들의 발현 조절한다는 사실을 밝혔다. 특히 Aco2에 의한 철 흡수 유전자들의 전사 후 조절 기작을 규명하여, 세포 내 철 항상성을 유지하는 새로운 방법을 제시하였다. 다기능 효소로서 진화적으로 보존된 기능과 분열성 효모 Aco2가 갖는 위치적 특성을 고려해볼 때, Aco2가 핵산 또는 단백질들과 상호작용하여 세포 내에서 또 다른 중요한 역할을 할 것으로 기대된다.

Organisms have devised an efficient way of regulating gene expression while sensing environmental stress. A unique example is a regulatory mechanism through a moonlighting metabolic enzyme such as mammalian aconitase. Aconitase, well-known as a mitochondrial TCA cycle enzyme, senses iron deficiency and acts as an iron regulatory protein (IRP) in mammals and metazoa, controlling the expression of mRNA related to iron homeostasis. From prokaryotes to mammals, multiple functions of aconitase have been reported. A recent study from our lab revealed that aconitase 2 (Aco2) in Schizosaccharomyces pombe, a fusion protein of aconitase and a mitochondrial ribosomal protein, exists in the nucleus in addition to mitochondria, and that it is required for protein translation in mitochondria and controls heterochromatin formation in the nucleus. More study is in need to unravel the role of Aco2 in the nucleus. Considering the conserved function of aconitase in various organisms, Aco2 is likely to interact with nucleic acids or proteins to regulate gene expression. To investigate the role of nuclear Aco2, phenotypes of aco2 mutant devoid of nuclear localization signal (NLS) (aco2ΔNLS) were examined. Transcriptome analysis revealed that the mutation caused increase in mRNAs coding for iron uptake transporters, such as Str1, Str3, Shu1. mRNA decay assay and RT-qPCR analysis showed that the half-life of iron uptake mRNAs increased in aco2ΔNLS, suggesting that the nuclear Aco2 may function in the degradation of those mRNAs. UV crosslinking RNA-IP (CLIP) analysis revealed that Aco2 directly binds to iron transporter mRNAs. Among exoribonuclease candidates, Rrp6 and Caf1 appear to affect degradation of these mRNAs. Co-IP experiments of Aco2-FLAG with Rrp6-TAP demonstrated that they interact physically. Therefore, it is concluded that nuclear Aco2 facilitates iron uptake mRNAs to be degraded by exoribonucleases such as Rrp6 under iron-sufficient conditions. Aco2 contributes to maintain intracellular iron homeostasis through post-transcriptional regulation of iron transporter genes. From transcriptome analysis and respiration-defective phenotype of aco2ΔNLS mutant, it is hypothesized that nuclear Aco2 may regulate genes involved in cellular respiration. Most of gene expressions for nuclear-encoded electron transport chain (ETC) were decreased by about 2-fold in aco2ΔNLS. mRNA decay assay revealed that the decay rate of ETC mRNAs in aco2ΔNLS did not changed, indicating Aco2 may be involved in transcriptional regulation of ETC genes. Therefore, whether Aco2 interacts with the transcription factors of ETC genes or Aco2 itself regulates the expression of ETC genes as a transcription factor are needed to be demonstrated. This study newly discovered that S. pombe Aco2 regulates genes related to iron homeostasis and cellular respiration. Specially, a new mechanism for maintaining iron homeostasis was revealed that Aco2 regulates the expression of iron-uptake genes at the post-transcriptional level. Given the unique features of the moonlighting enzyme and dual targeting, Aco2 is expected to play another important role in maintaining the life of cells.