Investigation of the spatio-temporal protective mechanism against mechanical wound in Arabidopsis leaves

Abstract

식물은 뿌리를 통해 땅에 고정되어 있는 고착 생활사를 갖는 다세포 유기체로, 이러한 생활방식 때문에 다양한 비생물적, 생물적 스트레스에 쉽게 노출된다. 이 중 물리적 상처는 환경 요인이나 생물적 요인에 의해 흔히 발생하는 비생물적 스트레스로, 식물의 생장 및 대사 과정에 영향을 끼친다. 따라서 애기장대 잎에서 상처를 받은 이후, 잎을 보호하기 위해 다양한 보호 메커니즘은 식물에게 있어 매우 중요하며, 이에 관한 연구는 지속적으로 진행되고 있다. 하지만 상처를 받은 이후의 시간대별로, 상처 부위로부터의 거리별로, 어떠한 세포 특이적인 보호 메커니즘이 활성화되는지에 대한 시공간적 관점에서의 이해는 아직 부족하다. 따라서 본 연구에서는 물리적인 상처 이후 식물 잎에서 활성화되는 다양한 보호 반응을 시공간적인 관점에서 재조명했다. 이를 위해, 상처 부위의 표면부터 내부까지 세포 특이적으로 세포벽 리모델링을 포함해 어떤 변화가 발생하는지, 시공간 특이적인 관점에서 다양하게 분석하였다. 더불어 이러한 세포벽 리모델링의 조절인자 및 하위 메커니즘을 규명하고, 활성산소종과 같은 상처 신호 전달자들의 상처 이후 시공간 특이적 분포를 가능하게 만드는 분자적 메커니즘 또한 규명하고자 했으며, 상처를 받은 이후 일어나는 세포벽 리모델링 같은 세포 특이적인 변화와 생물학적 스트레스가 가해졌을 때 일어나는 보호 반응을 상처 이후의 보호 반응과 비교, 분석하고자 했다. 이를 통해 물리적인 상처 이후에 발생하는 세포 특이적인 변화 양상에 대한 통찰을 높이고, 세포벽의 존재 하에 어떻게 손상 세포와 비손상 세포가 다른 공간으로 인식되고 구별되는지에 대한 질문에 답을 찾고자 했다. 식물 잎이 물리적인 상처를 받은 이후, 상처를 받은 부위(wound zone)에서부터 각각의 세포층별로 공간적으로 특이적인 반응을 보일 것이라고 예상했고, 실제로 상처를 받은 부위의 contact surface(wound zone에서도 경계에 위치한, 외부와 맞닿는 영역)에서 세포가 직접 손상을 입어 형태가 망가진 부분은 세포가 죽는 부분으로, 이 부분에서는 다양한 세포벽의 성분 또한 고농도로 축적되어 외부 물질의 유입을 막는 일차적인 보호 역할을 이른 시간내에 하는 것으로 보여진다. 물리적인 상처 이후 시간이 지날수록 상처 표면의 투과성은 감소했고, 상처 부위의 표면 및 내부가 채워지는 양상을 보였으며, 세포 사멸 영역은 점점 감소함을 관찰했다. 상처를 받은 부위에서 제일 가까우며 정상적인 세포 모양을 보이는 세포층 중에서도 가장 바깥쪽에 위치한 하나의 세포층은 일차적인 보호 역할을 하는 이후의 시간대에서 리그닌이 세포벽 모양을 따라 축적되는 특이적인 세포벽 리모델링 양상을 보였다. 이는 세포 사멸과의 공간을 분리하고, 이차적인 보호 역할을 하기 위함으로 보여진다. 그보다도 더 아래의 영역에서는 세포 분열과 같은 유전자가 발현됨에 따라, 세포의 분열 및 재생에 관련한 영역으로 보여지나 추가 확인이 필요하다. 다시 말하자면, 외부에서부터 직접적인 상처를 받아 세포가 파괴된 곳은 세포로서의 역할을 더 이상 지속할 수 없으므로 세포가 죽는 영역으로, 동시에 상처 부위를 통한 외부 물질의 유입을 막기 위해 세포벽 리모델링을 통한 sealing의 영역으로 구분된다. 또한 상처 부위와 조금 떨어진 곳에서는 리그닌의 특이적 세포벽 리모델링을 통해 보다 견고한 방어의 역할을 담당하며, 이보다도 더 떨어진 영역에서는 상처를 인식하여 잎의 보호 및 회복이 활발해지는 영역으로 생각된다. 영역별 역할을 종합해보면, 물리적인 상처를 입은 표면에서는 세포 사멸이, 세포 사멸이 발생한 인접한 영역에서는 세포벽의 integrity가 변화하며 세포벽 리모델링이, 그보다도 떨어진 영역에서는 세포의 생장 및 잎의 내부가 막히는 반응이 나타났다. 상처 부위의 관다발을 통해 ROS나 탈리에 관련된 유전자들의 반응을 확인할 수 있었는데, 이는 탈리 또한 큰 의미에서 세포와 세포가 떨어지는, 즉 물리적인 상처와도 비슷한 스트레스로서 탈리와 물리적인 상처 이후의 반응이 공통된 보호 반응에 관여할 수 있다는 가능성을 시사한다. 세포층별 수준에서의 영역에서는 직접적인 상처를 받은 경계면에서는 세포 사멸이, 상처를 입어 세포의 모양이 망가진 영역엔 suberin, cellulose, xyloglucan, carbohydrates와 같은 다양한 세포벽 성분이 축적되어 일차적인 방어 역할을 할 것으로 보여진다. 이후 세포의 모양을 정상적으로 유지하는, 상처 부위와 제일 가까운 한 층의 세포는 리그닌화를 통해 방어 역할을 하며, 이 주변의 영역에서는 세포의 생장이나 회복을 통해 내부를 채워 방어를 담당하는 것으로 보여진다. 본 연구는 물리적 상처 후 잎에서 일어나는 보호 메커니즘의 시공간적 특이성을 분석하고 이에 대한 조절인자를 규명하고자 하는 것으로, 여러 호르몬과 신호 전달 체계에 집중된 기존 연구에 새로운 시각의 통찰을 제시할 수 있다. 물리적인 상처 이후 식물 세포의 특이적 기능 및 시공간 특이적 조절 메커니즘을 이해하는 단초를 제공함으로써 동물과 다른 방면으로 진화해온 식물의 근본을 이해하는 토대를 제공할 수 있을 것이다. 추가적으로 물리적인 상처 이외에도 탈리 혹은 생물학적 스트레와 같은 여러 스트레스가 가해졌을 때의 시공간 특이적인 보호 반응에 대한 추후 연구 결과를 통해 다양한 스트레스 사이에서의 공통된 그리고 차이를 보이는 보호 메커니즘에 대해 비교 분석할 수 있을 것이다. 이는 식물의 면역 및 발달에 깊게 관련한 것으로, 작물 생산성의 증대를 비롯한 각종 농업 산업에 도움을 줄 수 있을 것으로 기대한다.

Plants, one of the multi-cellular organisms, can sustain their sessile life through their roots, and because of this, they are easily exposed to various biotic and abiotic stresses. Of these, mechanical wound is one of the common abiotic stresses caused by environmental or biological factors, which affect plant growth and metabolic processes. Thus, after being wounded in Arabidopsis leaf, various protective mechanisms are important for protecting its leaves and the plant itself. On account of this, relative research is ongoing. However, there is still a lack of insight into spatio-temporal specific perspective mechanisms of what cell-specific protection mechanisms are activated per time after damaging and per distance from the wound zone. Therefore, in this study, I would like to compare and analyze cell-specific changes such as cell wall remodeling and protective responses that occur post wounding. Through this, I would like to deepen our understanding of the pattern of cell-specific changes occurring after mechanical wounding and find answers to questions about how damaged and non-damaged cells are perceived and distinguished as different spaces under the presence of cell walls. The wounded plant recognizes the damaged area and emits various signals to protect itself and remodels the cell system along the signal transduction pathway to recognize signals. This study re-examines the various protective reactions that are activated in plant leaves after mechanical wounding from a spatio-temporal perspective. To this end, various analyses are carried out to investigate spatio-temporal protective reactions from the contact surface of the wound zone to the interior such as cell wall remodeling. Besides, I would like to identify the modulating factors of these protections and the molecular mechanisms enabling the spatio-temporal specific distribution of wound signal carriers post wounding such as ROS(Reactive Oxygen Species). Detailed research contents for this purpose are as follows. First, I analyzed spatio-temporal changes that occur in Arabidopsis leaves after mechanical wounding. Permeability around the wounded area was observed to decrease through TB staining. In addition, cell wall remodeling of the wounded area through ClearSee and cell wall staining took place in various cell wall components, especially cell wall remodeling through lignin showed noticeable results. After being wounded, the surface of the wound zone was checked to be filled more and more as time goes by using SEM, and this filling phenomenon was seemed to cell division because of the results being filled vertically to the wound zone analyzed by the Technovit section. Through NBT and DAB staining, I observed the pattern of reactive oxygen species around the wounded zone that differed by its species and by time post wounding. Furthermore, I could observe that the cell death area gradually decreased over the third-day post wounding using the Trypan blue and Evans blue staining. Based on these results, I concluded that a spatio-temporal protective response occurs in the wound zone after the mechanical wound. In order to identify various factors that mediated these various spatio-temporal defense responses, a total of seven categories were selected, including abscission, cell death, lignin biosynthesis, defense, growth, and ROS, and a total of 56 genes in each category were stained with GUS. To select genes representing spatio-temporally differently expressing patterns around the wound zone, this result was used to understand the role and adjustment mechanisms of each region, such as contact surface and surrounding zone, in each time of the wound. This study focusing on identifying the spatio-temporal changes of various protective reactions that occur post wounding were applied on plant leaves as well as the modulating factors that mediated these protective reactions. Through various spatio-temporal analyses occurring in Arabidopsis leaves, it provides an opportunity to re-exploration the meaning of the mechanical wound itself in Arabidopsis leaves and provides a clue to present a new angle of insights into present studies mainly focused on hormonal and signal transduction pathways. Also, this study identifies various response mechanisms and protective reactions occurring within plants after various stresses such as abscission and mechanical wound concerning the agriculture industry. This is related to plant immunity and development and is expected to help various agricultural industries such as increased crop productivity. It is expected to provide a cornerstone for the study of plant cell function and spatio-temporal controlling mechanism after mechanical wound, as well as a foundation for understanding the roots of plants that have evolved in different aspects from animals.