Proteome-wide study on RNA-protein interactions in multicellular organisms

Abstract

생성부터 분해에 이르기 까지 mRNA는 수십개 이상의 RNA 결합 단백질과 상호작용하며 mRNP 복합체 형태로 존재한다. 그와 같은 복합체 안에서 역동적으로 변화하고 긴밀하게 조절되는 RNA 결합 단백질의 구성은 mRNA 의 전사와 번역 그리고 분해에 이르는 모든 단계를 조절 한다. 그러므로 RNA와 단백질간의 상호작용의 조절은 전사 후 유전자 발현 조절에 필수 요소로 작용한다. 최근에 개발되고 소개된 RNA 결합 단백질 프로파일링 방법들은 생물체내에서의 교차 결합의 생성을 통해 가능하게 되었다. 자외선 빛 조사에 기반한 생물체 내에서의 RNA와 단백질간의 교차결합은 현재 RNA 생물학 전반에서 가장 널리 쓰이는 방법이지만 조직이나 다세포생물체 안으로 침투하는 깊이가 얕아 그와 같은 실험 환경에 대한 연구에서는 효과적이지 않다는 뚜렷한 한계점이 있다. 이 학위논문에서 나는 포름알데히드 기반의 생물체내 교차결합 방법을 이용하여 RNA 결합 단백질 구성요소를 프로파일링 하는 방법론을 개발하고 그 방법의 효용성을 확인하였다. 먼저 새롭게 개발된 방법론은 배양된 세포내에서 RNA와 직접결합하는 것으로 알려져있는 인간 단백질에 높은 특이성을 가짐을 확인할수 있었다. 나아가서 자외선 조사 기법 또는 포름알데히드에 기반한 방법에 의해 비교적 높은 효율로 분석된 RNA 결합 단백질들의 확인을 통해서 두 방법론의 특이점을 확인할수 있었다. 포름알데히드에 의해서 생성된 교차결합은 높은 온도에서는 빠르게 역반응을 일으키고 없어진다는 특징을 가지고 있다. 이와같은 성질을 이용하여 나는 펩타이드 수준에서의 RNA 결합 단백질 동정 방법론을 개발하여 포름알데히드에 의해서 RNA와 교차결합 되는 부근의 단백질 서열을 확인하는 것 또한 가능하게 하였다. 또한 포름알데히드에 기반한 RNA 결합 단백질 동정 방법은 Xenopus laevis 의 난자와 배아에 적용 되었고 그 결과는 자외선 조사 기반의 방법을 통하여 얻은 결과와 비교되었다. 새로운 방법론이 훨씬 더 포괄적이고 정확한 RNA 결합 단백질 동정을 가능하게 함이 그 비교 실혐결과를 통하여 확인되었다. 나아가서 두개의 다른 발생단계에서 동정된 단백질들의 양적 비교를 통하여 난소에서 초기 배아 발생과정에서 동적으로 변화된 RNA와 프로틴간의 상호작용을 확인 할수 있었다. 그 중 특히 주목할만한 결과는 중요한 단백질 번역 개시 인자인 eIF4E 와 eIF4E3 의 변화 등이었다. 펩타이드 수준에서의 RNA 결합 단백질 동정 방법론은 또한 포유류의 조직내에서의 RNA 결합 단백질 동정 방법을 개발하는데 사용이 되었다. 새롭게 개발된 방법은 쥐의 간에 적용되어 아데닌 꼬리를 가진 RNA와 전체 RNA에 특이적인 RNA 결합 단백질을 확인하는것을 가능케 하였다. 종합적으로 포름알데히드에 기반한 RNA 결합 단백질 분석 방법론이 개발되었고, 이 방법론의 효용성이 배양된 인간 세포, X. laevis 의 배아, M. musculus 의 간 조직 등에서 심도 있게 조사되고 확인되었다. HeLa 세포주에서 확인한 결과는 자외선 조사와 포름알데히드 라는 두개의 교차결합 방법의 차이가 RNA 결합 단백질들을 동정하는데 있어 큰 차이를 줄 수 있음을 시사한다. 이 연구에서 확인된 동물의 난자에서 배아로의 전환 과정에서의 역동적인 RNA 단백질간의 상호작용 변화는 앞으로 생명체 발생과정에서의 RNA 결합 단백질의 중요성을 연구하는데 있어서 단초 역할을 할것으로 기대된다. 마지막으로 이 방법론이 포유류의 조직에도 잘 적용될수 있다는 것을 확인한 것은 앞으로 이 학위논문에서 소개된 방법론이 다세포 생물 조직의 향상성 유지와 인간의 질병 발생 등을 연구하는데에 널리 사용될 수 있음을 시사한다.

From synthesis to decay, mRNA is bound with tens of RNA binding proteins (RBPs) and exists as a messenger ribonucleoprotein (mRNP) complex. Proper expression and function of mRNA in the biological systems are dependent on highly coordinated and dynamic change in the profile of RBPs over the course of mRNA transcription, translation, and decay. Distinct target and context specific RNA-protein interactions are thus central to many of the post-transcriptional gene regulatory mechanisms. Recently developed RBP profiling techniques rely on the use of various methods that crosslink RNA-protein interactions in vivo. Currently, UV light induced crosslinking (UVX) is the most widely utilized in vivo crosslinking method in RNA biology. Nonetheless UVX has notable limitations, including the limited applicability to the tissues of multicellular organisms, due to its limited depth of penetration in the biological systems. Here I introduce formaldehyde crosslinking (FAX) as an alternative chemical crosslinking method for RNA interactome capture (RIC). FAX-RIC captured the RNA-protein interactions with high specificity and efficiency in cell culture. Further analysis of the UVX or FAX preferentially enriched RBPs revealed the distinct crosslinking specificity of the two methods. FAX can be readily reversed with the high temperature. Utilizing this unique property, I developed the peptide-level FAX-RIC method to directly identify the RNA crosslinking site within the RBPs with tryptic peptide resolution. FAX-RIC method was then applied to the Xenopus laevis oocytes and embryos and compared with the respective result obtained by the UVX-RIC. The results demonstrate that FAX-RIC can enable highly comprehensive and relatively unbiased RNA interactome capture in multicellular organisms in vivo. Furthermore, quantitative comparison of the oocyte and embryo FAX RNA interactome revealed the dynamic remodeling of RNA-protein complex during oocyte to embryo transition (OET). FAX-RIC result was also compared to the total protein expression level change in OET. From this analysis I defined the OET specific dynamic RBPs whose enrichment rate change in FAX-RIC cannot be explained by the change in their protein expression level. Notably, I observed the significant change in the critical translation initiation factors during the OET, for instance, from canonical eIF4E to non-canonical eIF4E3. I utilized the peptide-level FAX-RIC method and developed a strategy for both reliable and versatile RNA interactome capture experiment in mammalian tissue samples. The newly developed protocol was applied to mouse liver for the determination of both poly A and total RNA interactome profile. Taken together, I developed and thoroughly investigated the utility of FAX based RIC method in wide range of biological samples from cultured human cell lines to X. laevis embryo and M. musculus liver. The result in HeLa cells demonstrate how use of either UV light and formaldehyde based in vivo crosslinking methods can significantly change the outcome of high throughput system wide RBP profiling methods. I then provide highly comprehensive RNA interactome profile of vertebrate embryo and mammalian tissue for the first time in vivo. Dynamic RNP complex remodeling in the animal oocyte to embryo transition revealed in this study can be the basis for further study into the individual RBPs regulatory mechanism and exact importance in the early animal development. Applicability of the FAX-RIC approach to the mammalian tissue warrants its broad future use in the studies of animal tissue homeostasis and human diseases.